農(nóng)藥危害風(fēng)險(xiǎn)及其殘留檢測用廣譜特異性抗體研究進(jìn)展

徐重新　劉敏　張霄　劉媛　張存政　劉賢金

摘要：農(nóng)藥殘留是威脅農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的關(guān)鍵危害因素之一，是農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管工作的重要對象。當(dāng)前已被開發(fā)和投入使用的農(nóng)藥種類紛繁復(fù)雜，農(nóng)藥殘留檢測工作任務(wù)多、責(zé)任大，因此建立一套可用于農(nóng)藥殘留檢測用的免疫學(xué)快速檢測方法一直是廣大科研工作者努力探索的目標(biāo)。本文分門別類梳理農(nóng)產(chǎn)品中主要農(nóng)藥殘留及其危害，探討國內(nèi)外抗體創(chuàng)制領(lǐng)域最新熱點(diǎn)技術(shù)，并就農(nóng)藥殘留檢測用廣譜特異性抗體研發(fā)和應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述及展望，旨在為指導(dǎo)農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的研發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：農(nóng)產(chǎn)品;農(nóng)藥殘留;廣譜特異性抗體;檢測方法

中圖分類號：TS207.5*3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0489-08

農(nóng)藥作為當(dāng)今世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可或缺的重要生產(chǎn)資料，主要用于防控病蟲害、雜草及鼠類等，有效保障了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來了巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益”。同時(shí)，也因?yàn)檗r(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的大量使用，其在農(nóng)產(chǎn)品、水及土壤環(huán)境中的殘留，給生態(tài)環(huán)境造成了巨大的負(fù)面影響，嚴(yán)重威脅人及動(dòng)物健康[23]。近年來農(nóng)藥引發(fā)的影響較大的農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事件也時(shí)有發(fā)生，如2010年海南“毒豇豆”事件、2013年山東濰坊“毒生姜”事件等，導(dǎo)致多名消費(fèi)者中毒，影響較大，嚴(yán)重挫傷廣大消費(fèi)者對中國農(nóng)產(chǎn)品的消費(fèi)信心[4]。農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)供過程的用藥安全關(guān)系到廣大老百姓的日常生活，是關(guān)乎國計(jì)民生的大事，黨中央和國務(wù)院各有關(guān)職能部門高度重視。習(xí)總書記2013年在中央農(nóng)村工作會(huì)議上就提出農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全是“產(chǎn)出來”與“管出來”的重要論斷，要求以“四個(gè)最嚴(yán)”確保廣大老百姓“舌尖上的安全”;2016年12月原國家衛(wèi)計(jì)委、農(nóng)業(yè)部和食藥總局聯(lián)合發(fā)布了食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《食品中農(nóng)藥殘留最大限量》（GB2763-2016），規(guī)定了中國食品中433種農(nóng)藥4140項(xiàng)最大殘留限量指標(biāo)，配套的檢測方法接近1000個(gè);與此同時(shí)，新修訂的《食品質(zhì)量安全法》和《農(nóng)藥管理?xiàng)l例》已分別在2015年10月1日和2017年6月1日正式頒布實(shí)施，《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》也在著手修訂當(dāng)中[5]。農(nóng)藥殘留監(jiān)測作為農(nóng)產(chǎn)品準(zhǔn)入市場前的最后一道工序，是保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的最后一道防線。當(dāng)前農(nóng)藥殘留檢測分析方法主要分為高精度的儀器分析法[氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）、氣相/液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC/HPLC-MS）]和快速檢測法（免疫分析法、酶抑制法、生物傳感器法、活體檢測法和液體工作站檢測法等）[6]。眾多方法中，基于“抗原-抗體”結(jié)合原理的免疫學(xué)檢測方法因其具有操作簡單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷、分析容量大等特點(diǎn)，適用于現(xiàn)場樣品分析和大容量樣品檢測，是農(nóng)藥殘留檢測的研究熱點(diǎn)刀。同時(shí)，很多類型的農(nóng)藥都具有通用結(jié)構(gòu)或共性區(qū)域等特點(diǎn)[8]，這也為農(nóng)藥檢測用廣譜特異性抗體提供了依據(jù)和可能，本文著重就廣譜檢測用抗體在農(nóng)藥殘留檢測上的研究及應(yīng)用狀況進(jìn)行概述。

1 當(dāng)前農(nóng)藥使用狀況及其主要?dú)埩麸L(fēng)險(xiǎn)

農(nóng)藥作為用于防控農(nóng)林病蟲害及雜草和調(diào)節(jié)農(nóng)作物生長的藥品的統(tǒng)稱，其具有來源廣、品種多、成分復(fù)雜等特點(diǎn)，是當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中必不可少的投入品，為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)保收做出了巨大貢獻(xiàn)[9]。與此同時(shí)，隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)對農(nóng)藥的過渡依賴，長期大量使用農(nóng)藥（特別是化學(xué)農(nóng)藥）導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、土壤功能退化、水體和環(huán)境污染、生物鏈結(jié)構(gòu)中斷以及生態(tài)失衡等一系列問題日益凸顯[2.10]。有證據(jù)表明，相當(dāng)一部分化學(xué)農(nóng)藥對人畜具有高“三致”（致癌、致畸、致突變）危害風(fēng)險(xiǎn)，越來越引起科學(xué)界和政府部門的高度關(guān)注[11-12]。按來源可將農(nóng)藥劃分為無機(jī)農(nóng)藥（砷酸類、氯酸類、硫酸銅等有毒有害無機(jī)物）、有機(jī)合成農(nóng)藥（有機(jī)氯類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、三嗪類和新煙堿類等合成農(nóng)藥）和生物農(nóng)藥（微生物農(nóng)藥、植物和動(dòng)物等代謝產(chǎn)物或提取物以及轉(zhuǎn)基因生物毒素）等三大類。本文按類別劃分，整理了幾種較為典型的代表性農(nóng)藥的主要用途、危害風(fēng)險(xiǎn)及其每日允許攝入量等信息（表1）。

無機(jī)農(nóng)藥主要是源于天然的無機(jī)類化學(xué)物或其制劑，在早期農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了重要作用，然而隨著科技的發(fā)展，其多數(shù)品種因具有毒性強(qiáng)、安全性差、藥效欠佳及使用量大等缺點(diǎn)，逐漸被淘汰，其中汞制劑、砷鉛類等早已被列入國家禁用農(nóng)藥名錄[13]。有機(jī)氯農(nóng)藥[如DDT（Dichlo-rodiphenyltrichloroethane）、六六六（Hexachlorocy-clohexane）、艾氏劑（Aldrin）等]主要以苯、環(huán)戊二烯以及松節(jié)油為原料，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解，具有持久性、遠(yuǎn)距離遷移性、生物蓄積性等特點(diǎn)，能引起人畜慢性中毒，目前有機(jī)氯農(nóng)藥已經(jīng)在世界范圍內(nèi)開始被陸續(xù)禁止生產(chǎn)和使用[14]。有機(jī)磷農(nóng)藥多數(shù)屬于磷酸酯類或硫代磷酸酯類化合物，其殘留引發(fā)的中毒特征主要是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)機(jī)能失調(diào)，引發(fā)身體不良狀況，中國農(nóng)藥食物中毒事件中有機(jī)磷農(nóng)藥高居首位，其中甲胺磷（Methami-dophos）、對硫磷（Parathion）、毒死蜱（Chlorpyri-fos）、甲拌磷（Phorate）等已被列入國家禁用農(nóng)藥名錄[15-1]。擬除蟲菊酯（Pyrethroid）是由天然除蟲菊素改變結(jié)構(gòu)后發(fā)展而來，是一類類似于天然除蟲菊素（Pyrethrin）的有機(jī)化學(xué)合成物（如高效氯氟氰酯、順式氯氰菊酯、順式氰戊菊酯等），因其對作物和多種害蟲具有高選擇性、高效率、低毒性、快速殺蟲和殘留少等優(yōu)點(diǎn)，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占據(jù)了較大市場份額，但菊酯類農(nóng)藥對水生生物具有特異性高毒活性，因而嚴(yán)重威脅水生生物群落平衡[17-18]新煙堿類有機(jī)農(nóng)藥也是近年來蓬勃發(fā)展的人工合成的超高效殺蟲劑[如啶蟲瞇（Acetamiprid）、噻蟲胺（Clothianidin）、吡蟲啉（Imidacloprid）、噻蟲啉（Thiacloprid）等]，具有廣闊的發(fā)展前景，對昆蟲具有高殺蟲活性，而對人及哺乳動(dòng)物低毒，屬于安全農(nóng)藥[19]。生物農(nóng)藥是非化學(xué)合成的天然生物源化合物，具有類似農(nóng)藥的作用，主要來源于生物活體或其代謝產(chǎn)物[如當(dāng)前使用較為成熟的有蘇云金芽孢桿菌Bt毒素（Bacillus?thuringiensis，Bt）、2，4-D（2，4-Di-chlorophenoxyacetic acid）、沙蠶毒素（Lumbriconer-is heteropoda）、阿維菌素（Abamectin）等]，一般認(rèn)為其具有對人畜和非靶標(biāo)生物安全、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗性、易于保護(hù)生物多樣性等優(yōu)點(diǎn)，對人類健康、環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都有重大的意義[2[20]，但近年也不斷暴露出一些安全隱患，引起關(guān)注[21-23]。

2 抗體的發(fā)展及其創(chuàng)制技術(shù)

抗體（Antibody，Ab）又稱為免疫球蛋白（Immu-noglobulin，Ig），是當(dāng)今生物醫(yī)藥、生命科學(xué)基礎(chǔ)研究以及免疫學(xué)診斷、分析與快速檢測等研究領(lǐng)域最熱門、使用最廣的蛋白質(zhì)材料[2425]。自1890年德國科學(xué)家首次證實(shí)在免疫動(dòng)物的血清里有免疫球蛋白存在，隨后抗體結(jié)構(gòu)與功能被不斷研究、挖掘和利用，并逐漸發(fā)展成為一門全新的熱門學(xué)科一免疫學(xué)（Immunology），到目前為止，抗體制備技術(shù)已經(jīng)從第一代的多克隆抗體（Polyclonal antibody，PAb）制備，第二代的單克隆抗體（Monoclonal antibody，MAb）制備發(fā)展到了第三代全新的基因工程抗體（Genetic engineering antibody，GEAb）創(chuàng)制階段[26]，多克隆抗體是天然抗原經(jīng)不同途徑免疫動(dòng)物產(chǎn)生的多種抗體的混合物，其制備過程簡單，生產(chǎn)成本低，無需特殊的儀器設(shè)備，而且親和力普遍較一般的單克隆抗體高，所以目前仍是抗體制備研究領(lǐng)域最為經(jīng)典和普及的首選方法;然而其存在抗原結(jié)合特異性不強(qiáng)、效價(jià)低、數(shù)量有限、難以重復(fù)制備、不利于批量生產(chǎn)等不可避免的缺陷[27]。目前多克隆抗體主要通過免疫兔、羊、鼠等動(dòng)物，采集其血清并經(jīng)純化（包括飽和硫酸銨鹽析、柱親和層析及吸附法等）獲得純度較高的抗體蛋白[26]。單克隆抗體是Kohler和Milstein在1975年發(fā)現(xiàn)并創(chuàng)制的純單一性抗體，具有抗原特異性和較高親和力的特點(diǎn)，由此從根本上解決了傳統(tǒng)多克隆抗體存在的抗原特異性和可重復(fù)性等問題，是抗體制備技術(shù)領(lǐng)域標(biāo)志性的突破，其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值尤為凸顯，現(xiàn)已獲批準(zhǔn)上市的單抗類藥物有近50種，且還有近300種已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[28-29]。目前制備的單克隆抗體以鼠源抗體居多，但單克隆抗體也存在制備周期長、過程繁瑣、專業(yè)技術(shù)要求高、制備條件苛刻以及雜交瘤細(xì)胞傳代退化等缺點(diǎn)[28]?；蚬こ炭贵w興起于20世紀(jì)80年代，是伴隨分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)等學(xué)科飛速發(fā)展而來的一項(xiàng)在分子水平對抗體基因進(jìn)行剪接修飾及表達(dá)與篩選的基因工程人工新型抗體創(chuàng)制技術(shù)[30]。Morrison等[31]在1984年首次報(bào)道人-鼠嵌合體在骨髓瘤細(xì)胞中成功表達(dá)，并結(jié)合Smith等[32]發(fā)明的噬菌體表面展示技術(shù)，從而催生出了噬菌體表面展示抗體庫技術(shù)，由此拉開了人工基因工程抗體創(chuàng)制技術(shù)的序幕，抗體就此擺脫動(dòng)物免疫過程并進(jìn)入能定向進(jìn)化成熟的新階段。目前基因工程抗體類型主要有人源化修飾抗體（如人鼠嵌合抗體）、單鏈抗體（如劍橋大學(xué)蛋白質(zhì)工程中心推出的Tomlinson I+J庫）、單域抗體或納米抗體（如駝源單域抗體，VHH）和隨機(jī)多肽抗體（如NEB公司推出的七肽庫、十二肽庫）等，此外還有Fab抗體、二硫鍵穩(wěn)定抗體、雙特異性抗體等衍生抗體3333目前可用于基因工程抗體展示表達(dá)的載體主要可以分為噬菌體表面展示系統(tǒng)、核糖體展示系統(tǒng)、酵母展示系統(tǒng)、細(xì)菌展示系統(tǒng)、桿狀病毒展示系統(tǒng)以及哺乳細(xì)胞展示系統(tǒng)等，其中以噬菌體表面展示抗體研究最早技術(shù)最成熟、普及最廣、應(yīng)用最成功，也最為人們所關(guān)注[3536]。噬菌體抗體是集抗體的表型與基因型于同一個(gè)噬菌體上，通過抗原固相篩選，從庫中獲得抗原特異性抗體的同時(shí)也獲得其基因，這樣極大方便了抗體進(jìn)一步定向成熟結(jié)構(gòu)分析以及多宿主轉(zhuǎn)移表達(dá)和大量制備等3738]。以噬菌體表面抗體展示技術(shù)為代表的新型基因工程抗體創(chuàng)制技術(shù)，有效避免了免疫及雜交等繁雜過程，使得抗體制備更方便、更省時(shí)、更省力，具備自動(dòng)化高通量篩選和制備特異性抗體的優(yōu)勢，是當(dāng)今抗體創(chuàng)制研究領(lǐng)域發(fā)展最具潛力的技術(shù)。

3 廣譜特異性抗體創(chuàng)制策略及其在農(nóng)藥殘留檢測上的應(yīng)用

農(nóng)藥雖然來源廣、成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣，但針對其殘留檢測的免疫學(xué)檢測方法卻大同小異，都是依托制備具有識(shí)別多種農(nóng)藥成分的廣譜特異性抗體，然后建立免疫學(xué)檢測方法。依據(jù)農(nóng)藥共性結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團(tuán)制備針對農(nóng)藥廣譜檢測用的抗體，是當(dāng)前農(nóng)藥殘留檢測免疫分析最主要的方式（表2）。針對小分子農(nóng)藥，大多數(shù)都是根據(jù)其類別的共性結(jié)構(gòu)或化學(xué)基團(tuán)來設(shè)計(jì)、合成與母體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的類似物作為通用性半抗原，然后以半抗原為免疫或包被抗原，制備或篩選廣譜特異性抗體[8]。文孟棠等[39]以擬除蟲菊酯通用結(jié)構(gòu)間苯氧基苯甲酸（PBA）為半抗原，免疫制備了具有同時(shí)識(shí)別4種菊酯類農(nóng)藥的單克隆抗體，檢測靈敏度在0.24～1.80 mg/L;Zhao等[40]以同樣的半抗原為包被抗原，從噬菌體抗體庫中成功篩選到具有識(shí)別多種菊酯農(nóng)藥的單域抗體，檢測靈敏度在0.33～0.86 μg/ml，并建立檢測方法用于實(shí)際樣品添加回收檢測。梁穎等[41]和賀江等[42]以甲氧基有機(jī)磷類農(nóng)藥通用結(jié)構(gòu)0，0-二甲基硫代磷酸酯（GMP）為半抗原，分別獲得了具有同時(shí)識(shí)別馬拉硫磷、稻豐散、樂果、亞胺硫磷等農(nóng)藥的廣譜多克隆抗體和人源單鏈抗體。此外，根據(jù)通用半抗原結(jié)構(gòu)，Wang等[43]制備了二乙氧基有機(jī)磷類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，Eugenia等[4制備了氨基甲酸酯類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，王升吉等[45]制備了2，4-D類農(nóng)藥廣譜多克隆抗體，Wang等[46]制備了阿維菌素類農(nóng)藥廣譜單克隆抗體。大分子農(nóng)藥的殘留免疫檢測用廣譜特異性抗體主要依據(jù)其三維結(jié)構(gòu)或者氨基酸序列相似的特點(diǎn)免疫制備或靶向庫篩選獲得[47]。Dong等[48-49]和Xu等[50]通過三維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)BtCry類生物農(nóng)藥Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F等毒素蛋白的DomainI區(qū)氨基酸和三維結(jié)構(gòu)具有高度同源性和相似性，并以此為依據(jù)通過設(shè)計(jì)分別成功制備或篩選到了具有識(shí)別多種Cry毒素的單克隆抗體和單域抗體，建立的免疫學(xué)分析方法可用于實(shí)際樣品添加回收檢測。此外針對特異性農(nóng)藥類別的殘留檢測，也有采用制備決定簇人工抗原[51]、雜交-雜交瘤抗體[52]以及基因工程抗體的特性改造[53-54]等方式的報(bào)道。

4 展望

總的來說，目前廣譜特異性抗體在農(nóng)藥殘留檢測上的應(yīng)用還處于實(shí)驗(yàn)室研究和初步探索階段，成熟的商品化產(chǎn)品很少，抗體材料和相應(yīng)的快速檢測技術(shù)還需進(jìn)一步加快研究步伐。就抗體材料創(chuàng)制來說，目前傳統(tǒng)多克隆抗體、單克隆抗體仍然是農(nóng)藥殘留免疫學(xué)檢測的主流，抗體親和活力相對穩(wěn)定、有保障，但從目前發(fā)展趨勢來看，基因工程抗體在不久的將來必將取代傳統(tǒng)多克隆抗體、單克隆抗體用于免疫檢測技術(shù)研發(fā)，不過其前提是基因工程抗體親和活力定向成熟技術(shù)要有實(shí)質(zhì)性的突破，目前定點(diǎn)突變（Site-directed mutagenesis）、易錯(cuò)PCR（Error PCR）、鏈置換（Chain shuffling）、DNA改組（DNA shuffling）等可用于抗體親和力改造的技術(shù)多數(shù)處于理論階段[65]。就免疫學(xué)檢測方法來說，目前最為常見的是ELISA法，其基于HRP顯色從而間接反映檢測物的存在與否，一般對檢測物的可分辨靈敏性不高，這樣極大限制了抗體的廣譜識(shí)別能力;為提高既有抗體的檢測}靈敏度從而擴(kuò)大抗體對農(nóng)藥的廣譜識(shí)別能力，可以大力發(fā)展時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（如抗體標(biāo)記非放射性稀土離子），如此達(dá)到進(jìn)一步提高抗體對農(nóng)藥的檢測靈敏度（可達(dá)1000倍以上）的目的[66]

參考文獻(xiàn)：

[1]周本新.農(nóng)藥功過誰人曾與評說[J].農(nóng)藥市場信息，2016（22）：6-8.

[2]GRUNG M，LIN Y，ZHANG H，et al.Pesticide levels and environmental risk in aquatic environments in China-a review[J].Environment International，2015，81：87-97.

[3]王運(yùn)儒，鄧有展，陳永森，等.廣西荔枝農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及膳食風(fēng)險(xiǎn)評估[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，49（9）：1804-1810.

[4]李培武，張奇，丁小霞，等.食用植物性農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（18）：3618-3632.

[5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部辦公廳關(guān)于征集《農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》修改意見的函（EB/OL）.（2014-11-24）[2014-11-28].http：//www.moa.gov.cn/govpublic/ncpzlaq/201411/120141128_4256470.htm.

[6]GRIMALT S，DEHOUCK P.Review of analytical methods for the determination of pesticide residues in grapes[J].Journal of Chromatography A，2016，1433：1-23.

[7]WATANABE E，MIYAKE S，YOGO Y.Review of enzyme-linked

immunosorbent assays（ELISAs）for analyses of neonicotinoid in-secticides in agro-environments[J].Journal of Agricultural andFood Chemistry，2013，61：12459-12472.

[8]劉媛，余向陽，梁穎，等.農(nóng)藥廣譜特異性抗體制備技術(shù)研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：428-432.

[9]周喜應(yīng).略論農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[J].中國植保導(dǎo)刊，2014，3 4（6）：67-70.

[10]YADAVA IC，DEVIN L，SYEDJ H，et al.Current status of persistent organic pesticides residues in air，water，and soil，and their possible effect on neighboring countries：a comprehensive review of India[J].Science of the Total Environment，2015，511：123-137.

[11]李敏，傅桂平，呂寧，等.高危害農(nóng)藥釋義及對我國農(nóng)藥管理的啟示[J].農(nóng)藥科學(xué)與管理，2016，37（6）：4-10.

[12]郭晨.高危農(nóng)藥：健康和環(huán)境的殺手[J].生態(tài)經(jīng)濟(jì)，2016，32（7）：6-9.

[13]BERENBAUM M R.Does the Honey Bee‘Risk Cup' runneth over？Estimating aggregate exposures for assessing pesticide risks toHoney Bees in agroecosystems[J].Journal of Agricultural andFood Chemistry，2016，64：13-20.

[14]周培學(xué).近30年有機(jī)氯農(nóng)藥和重金屬在中國北方嚙齒類動(dòng)物中的變化趨勢[D].杭州：浙江工業(yè)大學(xué)，2015.

[15]SONGA E A，OKONKWO J 0.Recent approaches to improving selectivity and sensitivity of enzyme-based biosensors for organo-phosphorus pesticides：a review[J].Talanta，2016，155：289-304.

[16]ZHANG W，ASIRI A M，LIU D，et al.Nanomaterial-based biosensors for environmental and biological monitoring of organophos-phorus pesticides and nerve agents[J].TrAC Trends in AnalyticalChemistry，2014，54：1-10.

[17]TU W，XU C，LU B，et al.Acute exposure to synthetic pyrethroids causes bioconcentration and disruption of the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in zebrafish embryos[J].Science of the TotalEnvironment，2016，542：876-885.

[18]杜潔，張怡，洪盼盼，等.擬除蟲菊酯對斑馬魚氧化代謝相關(guān)基因表達(dá)影響[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，44（3）：334-339.

[19]CIMINO A M，BOYLES A L，THAYER K A，et al. Efects of neonicotinoid pesticide exposure on human health：a systematic re-view[J].Environmental Health Perspectives，2017，125（2）：155-162.

[20]邱德文生物農(nóng)藥的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢分析[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（5）：679-684.

[21]JIN L，2ZHANGHN，LU Y H，et al.Large-scale test of the natural refuge strategy for delaying insect resistance to transgenic Btcrops[J].Nature Biotechnology，2015，33：169-174.

[22]FANG M，ROBERTJ K，PETER P M，et al.Bacterial diversity in rhizospheres of nontransgenic and transgenic corn[J].Appliedand Environmental Microbiology，2005，71（7）：4132-4136.

[23]BERNSTEIN I L，BERNSTEIN J A，MILLER M，et al.Immune

responses in farm workers after exposure to Bacillus thuringiensis pesticides[J].Environmental Health Perspectives，1999，107（7）：575-582.

[24]許卓斌，王旻.抗體與抗體藥物的前世今生[J].自然雜志，2016，38（4）：271-277.

[25]ZENG N，LI Y，DU M.Recent advances on modeling the lateral flow immunoassay[J].Journal of Advances in Biomedical Engineering and Technology，2015，2：46-50.

[26]王延華，李官成.抗體理論與技術(shù)[M].3版.北京：科學(xué)出版社，2013.

[27]賈慧娜，羅海玲.多克隆抗體制備方法的研究進(jìn)展[J].中國草食動(dòng)物科學(xué)，2012，S1：66-69.

[28]LIUJ K H.The history of monoclonal antibody development-Progress，remaining challenges and future innovations[J].Annals ofMedicine and Surgery，2014，3（4）：113-116.

[29]WEINER G J.Building better monoclonal antibody-based therapeutics[J].Nature Reviews Cancer，2015，15：361-370.

[30]SANGJ K，YOUNGW0O P，HYO J H.Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies[J].Molecules andCells，2005，20（1）：17-29.

[31]MORRISON S L，JOHNSON M J，HERZENBERG L A，et al. Chimeric human antibody molecules：mouse antigen-binding do-mains with human constant region domains[J].Proc Natl Acad SciUSA，1984，81（21）：6851-6855.

[32]SMITH G P.Filamentous fusion phage：novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface[J].Science，1985，228：1315-1317.

[33]錫建中，高寶龍，王建平.廣義新型抗體的研究進(jìn)展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2014（23）：54-56.

[34]HOOGENBOOM H R.Selecting and screening recombinant antibody libraries[J].Nature Biotechnology，2005，23（9）：1105-1116.

[35]何擴(kuò)，張秀媛，杜欣軍，等.基因工程抗體在食品安全檢測中應(yīng)用進(jìn)展研究[J].中國糧油學(xué)報(bào)，2014，29（8）：124-128.

[36]MERSICH C，JUNGBAUER A.Generation of bioactive peptides by biological libraries[J].Journal of Chromatography B，2008，861（2）：160-170.

[37]QIH，LU HQ，QIU HJ，et al. Phagemid vectors for phage display：properties，characteristics and construction[J].Journal ofMolecular Biology，2012，417（3）：129-143.

[38]LEDAGAARD L，KILSTRUP M，KARATT-VELLATT A，et al.Basics of antibody phage display technology[J].Toxins，2018，10：236-251.

[39]文孟棠，劉媛，閆帥，等.抗擬除蟲菊酯類農(nóng)藥廣譜性單克隆抗體的研制及鑒定[J].分析化學(xué)，2014，42（9）：1245-1251.

[40]ZHAO Y Y，LIANG Y，LIU Y，et al.Isolation of broad-specificity domain antibody from phage library for development of pyrethroid immunoassay[J].Analytical Biochemistry，2016，502：1-7.

[41]梁穎，劉媛，祝金鳳，等.甲氧基有機(jī)磷殺蟲劑廣譜特異性抗體的制備[J].分析化學(xué)，2008，36（5）：647-652.

[42]賀江，梁穎，樊明濤，等.噬菌體展示技術(shù)制備甲氧基有機(jī)磷農(nóng)藥抗獨(dú)特型抗體[J].分析化學(xué)，2011，39（2）：178-182.

[43]WANGST，GUI W J，GUO Y R，et al.Preparation of a multi-