蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量研究

耿彥梅 高晗 孫福仁 李雪利 張肖建 田方 董璐萌 曾永禎 李軍山

摘要：為了更好地評價不同產(chǎn)地蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率，對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量進行了研究。采用日本ShimadzuLC-20A型高效液相色譜儀，AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），以乙腈-磷酸為流動相，柱溫為28℃，流速為1mL/min，檢測波長為327nm，建立了蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸含量的測定方法。結(jié)果表明：15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率的均值為4.30%，均值±3SD為3.28%～5.32%;綠原酸含量均值為3.44mg/g，均值±3SD為0～7.16mg/g;綠原酸含量轉(zhuǎn)移率均值為36.54%，均值±3SD為0.66～72.42%;不同產(chǎn)地蒼耳子的出膏率較為穩(wěn)定，但綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率差異較大。經(jīng)方法學(xué)考察，蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸含量測定方法穩(wěn)定，具有較高的重復(fù)性、穩(wěn)定性及可信度，可用于蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價，為蒼耳子配方顆粒后續(xù)研究及大規(guī)模生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：醫(yī)藥工程;蒼耳子;標(biāo)準(zhǔn)湯劑;含量測定;綠原酸

中圖分類號：R917文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1534（2019）02-0122-06

蒼耳子為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實，秋季果實成熟時采收，經(jīng)干燥、去除梗和葉等雜質(zhì)而得[1]。蒼耳子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，原名葈耳實，列為中品?！侗静菥V目》記載，呆耳，亦名胡耳，蒼耳等。《本草品匯精要》記載蒼耳子“有毒”。蒼耳子所含化學(xué)成分復(fù)雜多樣，主要包括黃酮類、倍半萜類、噻嗪類、水溶性苷類、甾醇類、酚酸及其衍生物、蒽醌類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分[2-11]。研究表明，蒼耳子中各成分含量無明顯差異，但其中主要成分綠原酸的含量地域差異性較大[12-13]?，F(xiàn)代研究表明，蒼耳子具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗過敏、抗菌、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效[14-18]。

目前，人們對蒼耳子飲片化學(xué)成分及特征圖譜的研究相對比較透徹，但針對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究寥寥無幾。筆者通過對15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備及其主成分含量測定進行研究，探討蒼耳子煎液的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量評價，為蒼耳子配方顆粒后續(xù)研究及大生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

1主要儀器與材料

1.1儀器

日本ShimadzuLC-20A型高效液相色譜儀，AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），分析天平（賽多利斯），JM-A5002電子天平（余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司提供，十萬分之一），水循環(huán)真空泵（上海申生科技有限公司提供），DHG-9140A熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供），KH3200E型超聲波清洗器（江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供）。

1.2材料

綠原酸對照品，批號為110749-201718，純度為99.3%，中國食品藥品檢定研究院提供;甲醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;乙腈，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供;磷酸，HPLC級，美國ACS公司（上海）提供。

1.3飲片

15批蒼耳子飲片經(jīng)河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任鑒定為菊科植物蒼耳XanthiumsibiricumPatr.的干燥成熟帶總苞的果實。樣品詳細信息見表1。

2實驗部分

2.1標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

2.1.1制備方法

取蒼耳子藥材，壓扁，稱取100g，轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，第1次加8倍量純化水，浸泡30min，加熱煎煮20min，將藥液趁熱過50μm（300目）濾布;第2次加6倍純化水，煎煮15min，將藥液趁熱過50μm（300目）濾布。合并2次煎液。將提取液放入冰浴中快速冷卻，將冷卻后的提取液倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于真空低溫濃縮（溫度不超過60℃），濃縮至生藥量與藥液體積之比約為1∶3，將濃縮液冷凍干燥，即得蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.1.2制備條件

稱取蒼耳子飲片100g若干份，分別考察破碎、不同提取溶劑對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率3個參數(shù)的影響。結(jié)果見表2和表3。

從表2和表3可以看出，破碎、提取溶劑均對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率、綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率有影響。其中，蒼耳子壓扁后，有助于蒼耳子中成分的溶出，相關(guān)指標(biāo)明顯高于未壓扁組。純化水為提取溶媒時，干膏得率基本接近，而蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸含量、含量轉(zhuǎn)移率明顯高于飲用水組。

結(jié)合《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)要求》（征求意見稿）中關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備的指導(dǎo)原則，蒼耳子為辛涼解表藥，屬清熱類藥物，煎煮時間不宜過長，2次煎煮以20min和15min為宜;同時，當(dāng)加入8倍量水時，即可完全浸泡蒼耳子飲片，所以2次加水量分別為8倍和6倍。

2.1.315批湯劑的制備

按2.1.1項所述方法，制備15批不同產(chǎn)地、不同批號的蒼耳子藥材，得到15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2色譜條件

采用AgilentZorbaxEclipseC18色譜柱（2.1mm×250mm，5.0μm），流動相為乙腈-0.4%（體積分數(shù)，下同）磷酸溶液（二者體積比為10∶90），等度洗脫，流速為1mL/min，檢測波長為327nm，柱溫為28℃，進樣量為10μL。

2.2.1對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置于棕色量瓶中，加50%甲醇制成每1mL含50μg的溶液，即得對照品溶液（于10℃以下保存）。

2.2.2供試品溶液的制備

將蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉研細，取0.1g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入含5%甲酸的50%甲醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲20min，放冷，再稱定質(zhì)量，用含5%甲酸的50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45μm濾膜，即得。

2.2.3方法學(xué)考察

1）專屬性考察

使用空白溶劑作為陰性對照，通過對照品溶液指認蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品中的綠原酸峰，進行專屬性試驗，見圖1。在綠原酸出峰位置處，陰性樣品未見有明顯干擾，說明本方法的專屬性良好。

2）線性考察

精密稱定綠原酸對照品0.072531g，置于50mL棕色量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取上述儲備液1，2，4，6，8，10mL于20mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取以上各對照品溶液2μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以綠原酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，回歸方程為y=3×106x-128.41，R2=0.9999，表明綠原酸質(zhì)量濃度為0.073～1.451mg/mL時線性關(guān)系良好。

3）精密度考察

取蒼耳子飲片，按2.2.2項所述方法制備供試品1份，重復(fù)測定6次。結(jié)果顯示，蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸平均含量為4.10mg/g，RSD值為0.95%，說明儀器符合精密度要求。

4）重復(fù)性考察

取蒼耳子飲片，按2.2.2項所述方法制備供試品，平行制備6份樣品，測得蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的平均含量為4.09mg，RSD值為0.09%，符合《中華人民共和國藥典》中的相關(guān)規(guī)定（≤1.5%）。

5）穩(wěn)定性考察

取2.2.2項下供試品，分別在0，3，6，9，12h測定綠原酸含量。結(jié)果表明，蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉供試品在12h內(nèi)綠原酸的平均含量為3.89mg/g，RSD值為0.57%，表明供試品在12h內(nèi)較為穩(wěn)定。

6）準(zhǔn)確度考察

精密稱取蒼耳子（含量為4.09mg/g）標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉6份，每份0.05g。分別精密吸取綠原酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為0.03984mg/mL）5mL，按供試品溶液的制備方法，再分別精密加入含5%甲酸的50%甲醇溶液20mL，制成6份供試品溶液。加樣回收率的范圍為100.96%～102.69%，平均回收率為101.62%，RSD值為0.77%，符合《中華人民共和國藥典》中的相關(guān)要求（回收率限度為95%～102%）。

7）檢測限與定量限

檢測限：按照《中華人民共和國藥典》第四部附錄9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則進行測定，將已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，信噪比為3∶1，綠原酸最低質(zhì)量濃度為1.28×10-1μg/mL。

定量限：按照《中華人民共和國藥典》第四部附錄9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證指導(dǎo)原則進行測定，將已知低濃度供試品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，信噪比為10∶1，能被定量測定的綠原酸的最低質(zhì)量濃度為5.54×10-1μg/mL。

3結(jié)果及分析

3.115批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑綠原酸含量測定

取15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉，分別按2.2.2項所述方法制備供試品溶液，測定結(jié)果如表4和表5所示。

3.2綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率結(jié)果分析

15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均值為4.30%，均值±3SD為3.28%～5.32%;綠原酸含量均值為3.44mg/g，均值±3SD范圍為0～7.16mg/g;綠原酸含量轉(zhuǎn)移率均值為36.54%，均值±3SD為0.66～72.42%。15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率均在此范圍內(nèi)。

結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率差異較小，綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率差異較大，存在地域性差異?？傮w來看，內(nèi)蒙古地區(qū)的蒼耳子飲片含量及標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的含量及含量轉(zhuǎn)移率都較黑龍江、吉林地區(qū)高。

4討論

4.1提取溶劑及提取方式考察

通過對含5%甲酸的10%甲醇、含5%甲酸的30%甲醇、含5%甲酸的50%甲醇、含5%甲酸的70%甲醇、100%甲醇進行比較可知，含5%甲酸的50%甲醇對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的提取效率最高，故選擇含5%甲酸的50%甲醇作為提取溶劑。經(jīng)對比不同超聲時間（10，20，30，40min），發(fā)現(xiàn)超聲時間對蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑綠原酸的提取效率影響不大，考慮超聲時間過長會導(dǎo)致溶液過熱，故將超聲時間定為20min。

4.2色譜條件考察

分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-水4個流動相體系。結(jié)果表明，乙腈-0.1%磷酸對綠原酸的分離效果最佳，且各峰峰形相對較好。

4.3檢測波長選擇

分別選擇310，327，340nm作為檢測波長進行試驗，發(fā)現(xiàn)不同檢測波長下綠原酸的峰面積有較大差異，以327nm下測定的綠原酸色譜峰面積最大，且分離度較好，故選擇327nm作為檢測波長。

5結(jié)語

為規(guī)范中藥配方顆粒質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)研究，《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）指出，中藥配方顆粒需要建立的標(biāo)準(zhǔn)主要包括初始原料的中藥材標(biāo)準(zhǔn)、提取用原料飲片標(biāo)準(zhǔn)、中間體標(biāo)準(zhǔn)以及成品標(biāo)準(zhǔn)。為了更好地建立各中藥配方顆粒的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，建立相關(guān)含量的測定方法顯得尤為重要。藥材及飲片中各含量的測定方法在《中華人民共和國藥典》中已有相應(yīng)的規(guī)定，建立配方顆粒中間體及成品的標(biāo)準(zhǔn)是一項迫在眉睫的任務(wù)。

本次研究建立了蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸含量的測定方法，此方法具有較高的穩(wěn)定性，可用于蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量研究。通過選取具有代表性產(chǎn)地的15批蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑進行制備，確定了蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率范圍、綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率范圍，為蒼耳子配方顆粒的后續(xù)研究及大生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。

《中華人民共和國藥典》中規(guī)定蒼耳子羧基蒼術(shù)苷的含量不得超過0.35%。通過實驗發(fā)現(xiàn)，由于蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中羧基蒼術(shù)苷的含量大大降低，因而常規(guī)方法不能更準(zhǔn)確地測定羧基蒼術(shù)苷的含量。為更好地反映蒼耳子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，后續(xù)工作應(yīng)繼續(xù)完善蒼耳子中羧基蒼術(shù)苷含量的測定研究。

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