HPLC法同時測定半枝蓮飲片中4種黃酮類成分的含量及主成分分析

夏云嶺 張振凌 張洪坤 林欽賢 梁偉龍 路麗

中圖分類號 R283 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2839-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.20

摘 要 目的：建立同時測定半枝蓮飲片中野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素等4種黃酮類成分含量的方法，并進(jìn)行主成分分析。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent ZOXDB-C18，流動相為甲醇-乙腈（80 ∶ 20，V/V）-1%醋酸水溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為335 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。采用SPSS 20.0、SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析。結(jié)果：野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素進(jìn)樣量的線性范圍分別為0.131～1.446 μg（r=0.999 0）、0.031～0.345 μg（r=0.999 7）、0.005～0.055 μg（r=0.999 2）、0.024～0.268 μg（r=0.999 2）;定量限分別為1.178 8、0.602 9、0.744 1、1.079 1 ng，檢測限分別為0.353 6、0.106 1、0.223 2、0.323 7 ng;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%;加樣回收率分別為99.38%～100.56%（RSD=0.44%，n=6）、91.01%～96.81%（RSD=2.43%，n=6）、91.44%～97.34%（RSD=2.59%，n=6）、96.21%～99.26%（RSD=1.23%，n=6）。主成分分析結(jié)果顯示，主成分1和主成分2是影響樣品質(zhì)量評價的主要因子，2個主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為92.573%（>80%）;S14-3樣品綜合評分最高，整體質(zhì)量相對較好，S14-2、S14-1次之，這3批樣品均系半枝蓮種植基地藥材加工產(chǎn)品，質(zhì)量穩(wěn)定。結(jié)論：本方法簡單、快速，可用于同時測定半枝蓮飲片中4種黃酮類成分的含量;主成分分析可為半枝蓮飲片的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 半枝蓮;野黃芩苷;野黃芩素;木犀草素;芹菜素;高效液相色譜法;含量測定;主成分分析

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of 4 kinds of flavones such as sutellarin， sutellarein， luteolin and apigenin in Scutellaria barbata decoction pieces， and to conduct principle component analysis. METHODS： HPLC method was adopted. The determination was performed on Agilent ZOXDB-C18 column with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile （80 ∶ 20，V/V）-1% acetic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 335 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. Principal component analysis was carried out by SPSS 20.0 and SIMCA-P 13.0 software. RESULTS： The linear ranges of sutellarin， sutellarein， luteolin and apigenin were 0.131-1.446 μg（r=0.999 0）， 0.031-0.345 μg（r=0.999 7）， 0.005-0.055 μg（r=0.999 2）， 0.024-0.268 μg（r=0.999 2）， respectively. The limits of quantitation were 1.178 8， 0.602 9， 0.744 1， 1.079 1 ng; the limits of detection were 0.353 6， 0.106 1， 0.223 2， 0.323 7 ng;RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 99.38%-100.56%（RSD=0.44%，n=6）， 91.01%-96.81%（RSD=2.43%， n=6）， 91.44%-97.34%（RSD=2.59%， n=6）， 96.21%- 99.26%（RSD=1.23%，n=6）， respectively. By principal component analysis， principal component 1 and prinicipal component 2 were main influential factors of sample， quality accumulative variance contribution rate of them was 92.573%（>80%）. The comprehensive score of sample S14-3 was the highest， and the overall quality was relatively good; samples S14-2， S14-3 were the second. These 3 batches of sample were processed and produced in S. barbata planting base with stable quality. CONCLUSIONS： Established method is simple and rapid， and can be used for simultaneous determination of 4 kinds of flavones in S. barbata decoction pieces. Principle component analysis can provide reference for the quality control of S. barbata decoction pieces.

KEYWORDS? ?Scutellaria barbata; Sutellarin; Sutellarein; Luteolin; Apigenin; HPLC; Content determination; Principle component analysis

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物半枝蓮（Scutellaria barbata D. Don）的干燥全草[1]，主要含有黃酮類、二萜及二萜內(nèi)酯類、多糖類等成分[2]?，F(xiàn)代研究表明，半枝蓮具有良好的抗腫瘤活性，臨床上用于治療胰腺癌、肝癌等多種癌癥[3-5]，而其抗癌的主要活性物質(zhì)為黃酮類成分[6-7]。查閱歷版《中國藥典》及各省市炮制規(guī)范[8]，發(fā)現(xiàn)半枝蓮炮制方法較簡單，且受采收期、產(chǎn)地和種植方式等多種因素影響，市場上半枝蓮飲片質(zhì)量參差不齊?，F(xiàn)行2015年版《中國藥典》（一部）對半枝蓮以野黃芩苷和總黃酮為指標(biāo)進(jìn)行含量限定（野黃芩苷不得少于0.20%;總黃酮以野黃芩苷計，不得少于1.50%），采用索氏提取法進(jìn)行樣品制備[1]，過程較為復(fù)雜且耗時較長。為建立半枝蓮飲片中多種黃酮類成分同時測定的方法，同時簡化樣品制備方法、提高制備效率，本研究采用高效液相色譜法（HPLC）建立了同時測定半枝蓮飲片中野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素含量的方法，并采用主成分分析法對42批半枝蓮飲片的質(zhì)量進(jìn)行評價，旨在為其質(zhì)量控制及等級標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

e2695型HPLC儀，包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進(jìn)樣系統(tǒng)、柱溫箱及紫外檢測器（美國Waters公司）;FW-200型高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;UPT-Ⅱ-10T型優(yōu)普系列超純水器（成都超純科技有限公司）;DZKW-A型儀表恒溫水浴鍋（上海樹立儀器儀表有限公司）;GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;BT25S型十萬分之一天平、BSA224S-CW型萬分之一天平[賽多利斯科技儀器（北京）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

野黃芩苷對照品（批號：121293-201404）、野黃芩素對照品（批號：170818-201612）、木犀草素對照品（批號：103200-201305）、芹菜素對照品（批號：100755-201236）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%;甲醇、乙腈、冰醋酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

半枝蓮飲片經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院張振凌教授鑒定為唇形科植物半枝蓮（Scutellaria barbata D. Don）干燥地上部分的加工炮制品，樣品來源信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZOXDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇-乙腈（80 ∶ 20，V/V;流動相A）-1%醋酸水溶液（流動相B），梯度洗脫（0～20 min，28%A→35%A;20～30 min，35%A;30～50 min，35%A→70%A）;檢測波長：335 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素對照品各適量，加甲醇制成含野黃芩苷313 μg/mL、野黃芩素305 μg/mL、木犀草素158 μg/mL、芹菜素244 μg/mL的單一對照品貯備液。分別精密吸取上述各單一對照品貯備液2.1、0.515、0.158、0.5 mL，置于同一5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得含野黃芩苷131.5 μg/mL、野黃芩素31.4 μg/mL、木犀草素5.0 μg/mL、芹菜素24.4 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末（過3號篩）0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 精密量取70%甲醇50 mL，置于具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，冷卻至室溫，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素分離度均大于1.5，芹菜素分離度大于1，且峰形對稱、分離良好，理論板數(shù)均大于5 000;陰性對照溶液對測定無干擾。

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、3、5、7、9、11 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍見表2。

2.1.7 定量限與檢測限考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋，按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限。結(jié)果，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素的定量限分別為1.178 8、0.602 9、0.744 1、1.079 1 ng，檢測限分別為0.353 6、0.106 1、0.223 2、0.323 7 ng。

2.1.8 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.15%、0.31%、1.59%、0.39%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（編號：S1-3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素峰面積的RSD分別為0.91%、0.46%、0.68%、0.82%（n=6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.10 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（編號：S1-3）粉末，共6份，每份約0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算4種待測成分的含量。結(jié)果，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素的平均含量分別為0.74%、0.06%、0.02%、0.03%，RSD分別為1.97%、0.56%、1.92%、1.76%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.11 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（編號：S1-3）粉末，共6份，每份約0.25 g，精密加入混合對照品溶液（取野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素對照品適量，加甲醇制成含野黃芩苷1.91 mg/mL、野黃芩素0.138 mg/mL、木犀草素0.038 mg/mL、芹菜素0.071 mg/mL的混合溶液）適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.1.12 樣品含量測定 取42批樣品粉末各適量，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算樣品中4種待測成分的含量，平行操作3次，結(jié)果見表4。

2.2 主成分分析

2.2.1 相關(guān)性 對4個指標(biāo)成分進(jìn)行主成分分析前先行KMO檢驗和Bartlett檢驗[9-11]，得到KMO度量值為0.794，提示可以進(jìn)行主成分分析。Bartlett檢驗法結(jié)果顯示，P<0.001，提示各變量間存在顯著的相關(guān)性，可進(jìn)行因子分析以評價各變量間的共性，結(jié)果見表5。

2.2.2 特征值和方差貢獻(xiàn)率 由于4個指標(biāo)成分含量差異較大，故先采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，結(jié)果見表6。由表6可知，前2個成分的特征值均大于1，且累積方差貢獻(xiàn)率為92.573%（>80%），故此2個成分可反映半枝蓮飲片中4個指標(biāo)成分的大部分信息，因此可提取這兩者為主成分對42批樣品進(jìn)行質(zhì)量評價。

2.2.3 模型建立 采用SPSS 20.0軟件，根據(jù)“成分矩陣”中各主成分對應(yīng)的載荷，選擇菜單中“轉(zhuǎn)換”“計算變量”，得到特征向量，結(jié)果見表7。

采用SPSS 20.0軟件，主成分“抽取方法”選擇“相關(guān)性矩陣”，經(jīng)最大方差法旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)因子顯示設(shè)置“降序排列”，同時根據(jù)特征向量矩陣建立主成分分析模型[9]：

F=65.587%F1+26.986%F2

F1=-0.007X1+0.563X2+0.588X3+0.581X4

F2=0.960X1+0.096X2-0.220X3+0.142X4

X1、X2、X3、X4分別為野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素原始變量標(biāo)準(zhǔn)化后的變量，F(xiàn)1、F2為主成分1和主成分2得分，以各主成分的貢獻(xiàn)率對主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，得到綜合得分（F），結(jié)果見表8。由表8可知，樣品S14-3綜合評分最高，整體質(zhì)量相對較好，S14-2、S14-1次之，這3批樣品均系半枝蓮種植基地采收藥材加工飲片（注：Zi表示各成分標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)）。

將42批樣品含量測定結(jié)果的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，數(shù)據(jù)標(biāo)度方式選擇“Pareto Scaling”，然后進(jìn)行主成分分析。由于從4個指標(biāo)成分中提取了2個指標(biāo)成分為主成分，故選擇生成二維散點圖，詳見圖2。由圖2可知，42批樣品分布在4個象限，第一象限有7批樣品，分別為S14-1、S14-2、S14-3、S9-1、S9-2、S9-3、S4-1;第二象限有10批樣品，分別為S10-1、S10-2、S10-3、S7-2、S7-3、S4-2、S4-3、S2-1、S2-2、S2-3;第三象限有9批樣品，分別為S11-2、S11-3、S8-1、S8-2、S8-3、S7-1、S1-1、S1-2、S1-3;第四象限有16批樣品，分別為S13-1、S13-2、S13-3、S12-1、S12-2、S12-3、S11-1、S6-1、S6-2、S6-3、S5-1、S5-2、S5-3、S3-1、S3-2、S3-3。

3 討論

本研究考察了甲醇-0.1%甲酸水溶液[5]、乙腈-1%冰醋酸水溶液[12]、甲醇-0.1%磷酸水溶液[13]、甲醇-1%醋酸水溶液等不同流動相系統(tǒng)的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇洗脫能力強，色譜峰分離度較高，色譜峰形在以1%醋酸水溶液為水相時較好，但以甲醇-1%醋酸水溶液為流動相進(jìn)行洗脫時，存在野黃芩苷峰純度及分離度不高的情況，故加入一定比例乙腈，以甲醇-乙腈（80 ∶ 20，V/V）-1%醋酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。在此流動相系統(tǒng)下，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以野黃芩苷峰計大于10 000。

含量測定結(jié)果顯示，野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素含量分別為0.52%～1.25%、0.03%～0.25%、0.01%～0.05%、0.02%～0.12%。野黃芩苷含量最高，是半枝蓮的代表成分，但僅以野黃芩苷為指標(biāo)進(jìn)行含量測定過于單一，不能全面反映半枝蓮飲片的整體質(zhì)量。雖然野黃芩素、木犀草素、芹菜素含量較低，但不同產(chǎn)地樣品中這3種成分含量差異較大[14]，故仍然有必要對其進(jìn)行含量測定和主成分分析。

主成分分析主要是對樣本的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行降維，取其主要成分進(jìn)行投影分析和判別分析[15]，該分析方法可從復(fù)雜的結(jié)果中篩選出主要影響因素，以突出主要問題，使復(fù)雜的問題簡單化，得到觀察結(jié)果中的一般聚類、趨勢或異常值[16]。本研究的主成分分析結(jié)果顯示，S14-3綜合得分最高，S14-2、S14-1次之，S1-3為最低（-1.37分），提示42批樣品質(zhì)量存在較大差異。S14-1、S14-2、S14-3樣品綜合得分較高，均為半枝蓮種植基地藥材生產(chǎn)，可能與國家中藥標(biāo)準(zhǔn)化項目實施后，企業(yè)通過對半枝蓮進(jìn)行科學(xué)化管理和規(guī)范化種植[17]，采用傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方式（產(chǎn)地整枝曬干進(jìn)行產(chǎn)地加工[18]），按照最佳炮制工藝切制，使得藥材成分損失小，總黃酮、野黃芩苷、浸出物含量均較高，飲片質(zhì)量更加穩(wěn)定有關(guān)[19-21]。散點圖結(jié)果顯示，S14-1、S14-2、S14-3緊密聚集，表明該企業(yè)樣品質(zhì)量穩(wěn)定，可與其他企業(yè)樣品明顯區(qū)分開。

半枝蓮于1990年被收錄入《中國藥典》（一部）[22]，入藥部位為“唇形科植物半枝蓮（Scutellaria barbate D. Don）的干燥全草”，但經(jīng)產(chǎn)地走訪、市場調(diào)研等發(fā)現(xiàn)，半枝蓮每年可采收3～4次，幾乎不存在全草入藥的情況。究其原因，可能為半枝蓮初入1990年版《中國藥典》（一部）時為野生，采收多為連根拔起，故全草入藥;近些年半枝蓮被列入國家重點推薦發(fā)展的63種緊缺中藥材之一，實現(xiàn)了農(nóng)田規(guī)模種植，故采收時僅“割取地上部分”，以干燥地上部分入藥。雖然半枝蓮全草皆可入藥，但結(jié)合市場實際流通情況，建議有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)將其入藥部分改為“唇形科植物半枝蓮（Scutellaria barbate D. Don）的干燥全草或地上部分”。

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（收稿日期：2019-04-13 修回日期：2019-07-22）

（編輯：陳 宏）