羅格列酮對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的改善作用及機(jī)制

竇慧 巫相宏

摘要：目的：探討羅格列酮（rosiglitazone ，RSG）對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HCAEC）功能障礙的作用及機(jī)制。方法：將HCAEC分為空白對(duì)照組、脂多糖組（分別用0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L四種濃度的LPS刺激HCAEC，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力后選出最適濃度）、羅格列酮（RSG）組、脂多糖+羅格列酮（LPS+RSG）組，采用Western blot（蛋白免疫印跡法）測(cè)定縫隙連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)量。結(jié)果：（1）MTT法檢測(cè)四組LPS濃度對(duì)細(xì)胞活力影響的結(jié)果顯示，隨著LPS濃度增加（LPS濃度≥1 mg/L），抑制HCAEC作用增強(qiáng)，導(dǎo)致其活力降低（P<0.05）；（2）由Western blot結(jié)果表明，LPS組對(duì)比空白對(duì)照組，Cx43的表達(dá)量增多；HCAEC中加入RSG預(yù)處理1h后+LPS共培養(yǎng)組較LPS組，Cx43蛋白的表達(dá)水平下降（P<0.01）。結(jié)論：RSG能抑制LPS誘導(dǎo)的HCAEC中Cx43表達(dá)的增加，減輕冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能損害，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：羅格列酮；縫隙連接蛋白43；脂多糖；人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞

【中圖分類號(hào)】361.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2019）02-160-03

前言

隨著國(guó)家綜合實(shí)力的提升，人民生活質(zhì)量不斷改善以及計(jì)劃生育的施行，中國(guó)人口老齡化問(wèn)題日漸突出，隨之而來(lái)，城鄉(xiāng)居民中患動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）疾病占比較前增多。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，與動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄相關(guān)的心血管疾病可能是未來(lái)十年發(fā)展中國(guó)家導(dǎo)致死亡的主要原因[1， 2]。研究表明，在AS的形成過(guò)程中，血管內(nèi)皮的縫隙連接蛋白（connexins，Cx）[3]發(fā)揮了重要作用。羅格列酮可通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)。該實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察羅格列酮對(duì)LPS誘導(dǎo)的HCAEC中Cx43表達(dá)水平變化的影響，探討羅格列酮是否有抑制血管炎癥反應(yīng)的作用。

1.材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

原代HCAEC、內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基、青-鏈霉素（P-S）、胰蛋白酶、MTT、LPS、RSG、二甲基亞砜（DMSO）、RIPA裂解液、BCA蛋白試劑盒、兔抗鼠Cx43、兔抗鼠GAPDH內(nèi)參蛋白抗體、羊抗兔熒光二抗。

1.2主要試劑配制

LPS用無(wú)血清的培養(yǎng)基溶解，RSG用DMSO溶解，磷酸鹽緩沖液（PBS）溶解MTT，以上三種溶液放于-20℃冰箱保存。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

將HCAEC從液氮罐中取出置于37℃水浴箱中，溶化后立即轉(zhuǎn)移到含9ml完全培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶中，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，酌情1-3天換液一次，待瓶?jī)?nèi)細(xì)胞密度達(dá)80%以上即可傳代。以2-5代為最佳研究對(duì)象。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及處理

（1）LPS對(duì)細(xì)胞活力影響的檢測(cè)：用MTT法檢測(cè)五組濃度梯度的LPS處理HCAEC 24h后的細(xì)胞活力；（2）Western blot法測(cè)定以下四組細(xì)胞（①空白對(duì)照組、②0.1mg/L LPS組、③10ug/ml RSG組、④0.1mg/L LPS+10μg/ml RSG組（先LPS預(yù)處理1h后再予RSG共同處理24h））中Cx43蛋白的表達(dá)量，上述四組細(xì)胞均培養(yǎng)24h后提取總蛋白。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

當(dāng)細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且密度達(dá)80%-90%時(shí)，胰酶消化，離心，吹打重懸，于96孔板中每孔接種1×104 個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)時(shí)，在無(wú)血清條件下以不同濃度LPS處理HCAEC 24h，在每孔加入20μl的MTT溶液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，吸棄復(fù)孔的上清液，每孔加入150μlDMSO，搖床振蕩10 min，待結(jié)晶溶解后選擇波長(zhǎng)490nm的酶標(biāo)儀測(cè)其吸光度值。

1.6 Western blot法檢測(cè)HCAEC中Cx43蛋白的表達(dá)量

將HCAEC接種于六孔板上，根據(jù)不同組的條件分別處理HCAEC后棄去培養(yǎng)液，使用冷卻的1×PBS清洗3次后棄去，冰上加入提前裝有PMSF的RIPA裂解液裂解10min，用離心管收集細(xì)胞刮刮取的裂解物后離心，取一小部分用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，剩余上清液放入1.5ml離心管后加入上樣緩沖液后置于100℃沸水中變性13分鐘。行SDS-PADE電泳，每道上樣20μg蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，1×TBST 洗膜5 min×3次，5%脫脂奶粉封閉1h， TBST洗三次，蛋白一抗4℃孵育過(guò)夜， TBST洗三次后加入熒光二抗，室溫?fù)u床孵育1 h， TBST洗3次，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描成像，Image-J圖像分析軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白Cx43與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值反映其相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，多組組間總體均數(shù)的差異比較用單因素方差（one way ANOVA）分析，組間兩兩比較用SNK檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 不同濃度LPS對(duì)人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力的影響

不同濃度梯度LPS處理HCAEC 24h后，以空白組為對(duì)照，當(dāng)LPS濃度大于1mg/L時(shí)，HCAEC活力降低（P<0.05），且隨著LPS濃度升高，對(duì)HCAEC活性的抑制作用增強(qiáng)。因此，選擇0.1mg/L LPS作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的處理濃度。

2.2 不同處理對(duì)HCAEC中Cx43蛋白水平的影響

與對(duì)照組（0.45±0.015）相比，LPS組Cx43蛋白（0.58±0.004， P<0.01）水平顯著上升；與LPS組相比，LPS+RSG組Cx43蛋白（0.32±0.025， P<0.01）水平顯著下降。

3.討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其特點(diǎn)是在受累及的動(dòng)脈某些部位的內(nèi)膜下發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)沉積，伴血管平滑肌細(xì)胞增殖和纖維基質(zhì)成分聚集，進(jìn)一步發(fā)展成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。脂多糖是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞跨膜受體Toll樣受體4（toll like receptor 4，TLR4）結(jié)合，激活G蛋白激酶?jìng)鲗?dǎo)通路，引起細(xì)胞內(nèi)靶蛋白的磷酸化，促使細(xì)胞骨架蛋白的解聚和重組，細(xì)胞間縫隙形成，進(jìn)而改變內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)及功能，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[4]。

縫隙連接（gap junction） 是由縫隙連接蛋白（ connexin，Cx）組成的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的一個(gè)特定區(qū)域，為細(xì)胞間離子、小信號(hào)分子、第二信使的直接流通通道，協(xié)調(diào)細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化的生理過(guò)程。作為細(xì)胞間相互連接的主要方式，與動(dòng)脈粥樣硬化的形成產(chǎn)生重要作用?？p隙連接蛋白是一種在多種組織中表達(dá)的蛋白質(zhì)的同質(zhì)家族[5]，其中三種縫隙連接蛋白參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，分別是Cx37， Cx40 和 Cx43。Cx37和Cx40具有延緩動(dòng)脈粥樣硬化的作用[6， 7]。Cx43在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中呈表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)，其主要在平滑肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[4]。在心室組織中存在大量表達(dá)由Cx43組成的縫隙連接，具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)、低電阻的特點(diǎn)，其作為基礎(chǔ)使心臟作為一個(gè)功能性合胞體進(jìn)行同步收縮，在維持心臟正常電生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[8]。研究證明Cx43通過(guò)激活A(yù)TP釋放，促進(jìn)單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮間的粘附力增加，繼而誘發(fā)血管炎性反應(yīng)[9]。Cx43 MAPK 磷酸化是血小板源性生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的血管平滑肌增生所必需的，而后者在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[10]。該研究使用LPS處理HCAEC細(xì)胞，研究揭示： LPS組中Cx43的蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（P<0.01）。提示LPS可能通過(guò)增加Cx43的表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)AS的形成。

核受體超家族中的核轉(zhuǎn)錄因子之一過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPARγ），是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。有研究表明[11]，噻唑烷二酮類合成的PPARγ配體對(duì)心血管疾病具有有益的作用。累積的數(shù)據(jù)表明，PPARγ活化是抵抗素蛋白的重要調(diào)控因子[12]，因此有望成為動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥的治療靶點(diǎn)。PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮可通過(guò)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路下調(diào)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變中的主要蛋白酶MMP-2[13]從而抑制炎癥反應(yīng)過(guò)程。在本實(shí)驗(yàn)中，使用羅格列酮來(lái)拮抗LPS誘導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)，結(jié)果顯示，與LPS組相比，LPS+RSG組的Cx43蛋白表達(dá)量明顯下降（P<0.01）。

綜上所述，LPS可誘導(dǎo)HCAEC中Cx43的表達(dá)量增多，而羅格列酮可以抑制LPS誘導(dǎo)HCAEC中Cx43的產(chǎn)生，從而起到抗炎保護(hù)作用。這也可能為AS的治療提供一種新的治療思路。

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