阿奇霉素對哮喘小鼠氣道炎癥及細胞因子表達的影響

楊軍霞　郭英萌

[摘要] 目的 觀察支氣管哮喘小鼠炎性細胞因子表達，探討阿奇霉素對肺部炎癥及細胞因子表達的影響。 方法 6～8周齡的雌性BALB/c小鼠32只，采用隨機數字表法將其分為四組，A組：生理鹽水對照組;B組：哮喘組;C組：阿奇霉素干預組;D組：地塞米松干預組，每組8只。分別于第0、7、14天予B、C、D組小鼠腹腔注射雞卵白蛋白（OVA）25 μg+Al（OH）3 1 mg。致敏1周后，2%OVA生理鹽水溶液霧化吸入激發(fā)。A組予等量生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)，激發(fā)6 d。C組于第14天起，霧化吸入1 h后皮下注射阿奇霉素0.4 mg/mL，連續(xù)7 d。D組于第14天起，霧化吸入1 h后皮下注射地塞米松磷酸鈉2 mg/kg，連續(xù)7 d。激發(fā)后24 h，觀察各組小鼠肺組織病理表現，收集左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF）。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、嗜酸性粒細胞（EOS）百分比及白細胞計數。 結果 B、C、D組小鼠成功造模，存在哮喘發(fā)作癥狀及氣道炎癥病理表現。與A組比較，B組小鼠BALF中白細胞總數、EOS百分比、IL-8及TNF-α含量均顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與B組比較，C組和D組小鼠BALF中白細胞總數、EOS百分比、IL-8及TNF-α含量均顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。C、D兩組各項指標比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。 結論 阿奇霉素可以抑制IL-8、TNF-α的表達，阻礙Th2型細胞因子的生成，緩解氣道炎癥。

[關鍵詞] 支氣管哮喘;阿奇霉素;炎癥;細胞因子

[中圖分類號] R562 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）06（c）-0021-04

Effects of Azithromycin on airway inflammation and cytokine expression in bronchial asthma mice

YANG Junxia ? GUO Yingmeng

Department of Pediatrics， Linyi Central Hospital， Shandong Province， Linyi ? 276400， China

[Abstract] Objective To observe the expression of inflammatory cytokines in bronchial asthma mice， and to explore the effect of Azithromycin on the expression of pulmonary inflammation and inflammatory cytokines. Methods According to random number table， 32 female BALB/c mice aged 6-8 weeks were randomly divided into four groups： group A， normal saline control group; group B， asthma group; group C， Azithromycin intervention group; group D， Dexamethasone intervention group， with 8 mice in each group. Mice in group B， C and D were intraperitoneally injected with ovalbumin （OVA） 25 μg （OH）3 1 mg at 0， 7， 14 days， respectively. After sensitization for 1 week， 2% OVA solution was nebulized and inhaled. Group A was sensitized and stimulated with normal saline instead of OVA for 6 days. In group C， Azithromycin （0.4 mg/mL） was injected subcutaneously 1 hour after atomization inhalation at day 14 consecutively for 7 days. In group D， 2 mg/kg of Dexamethasone Sodium phosphate was injected subcutaneously 1 hour after atomization inhalation at day 14 consecutively for 7 days. The pathological manifestations of lung tissues in each group were observed 24 hours after stimulation， and the left bronchoalveolar lavage fluid （BALF） was collected， and the percentage of interleukin-8 （IL-8）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， eosinophilic granulocytes （EOS） and white blood cell count were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Mice in group B， C and D were successfully modeled and presented asthma attack symptoms and pathological manifestations of airway inflammation. Compared with group A， the total number of white blood cells， percentage of EOS， IL-8 and TNF-α contents in BALF of mice in group B were significantly increased， with statistically significant differences （P < 0.01）. Compared with group B， the total number of white blood cells， percentage of EOS， IL-8 and TNF-α contents in BALF of group C and group D were significantly reduced， with statistically significant differences （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in the indicators between group C and D （P > 0.05）. Conclusion Azithromycin can inhibit the expression of IL-8 and TNF-α， inhibit the production of Th2 cytokines， and relieve airway inflammation.

[Key words] Bronchial asthma; Azithromycin; Inflammation; Cytokines

支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，Th2細胞在誘導和維持免疫炎癥過程中起重要的作用。Th2細胞主要分泌白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促進IgE的合成、嗜酸性粒細胞（EOS）的生長與分化，以及黏液分泌、氣道高反應（AHR）的發(fā)生。氣道平滑肌細胞（ASMCs）具有收縮功能及分泌功能，能分泌趨化因子、細胞因子等多種炎性介質，對氣道炎癥的發(fā)生及發(fā)展起著重要的作用。研究表明[1-3]，與哮喘發(fā)生有關的Th2型細胞因子IL-8及趨化因子TNF-α等在ASMCs上均有表達，它們在參與氣道炎癥的發(fā)生、EOS的生長與分化以及AHR的發(fā)生過程中均起重要作用。

目前，糖皮質激素是預防和治療哮喘的主要藥物，但長期應用存在較多副作用，且越來越多的哮喘患者出現了激素抵抗的現象。近年來的研究發(fā)現阿奇霉素具有潛在的抗炎、免疫調節(jié)的作用[4-5]，哮喘患者應用阿奇霉素可以明顯降低氣道炎性反應，改善哮喘的癥狀、體征，降低AHR，且未見明顯副作用。這些治療作用可能是阿奇霉素抑制ASMCs的炎癥引起的。本研究旨在觀察阿奇霉素對哮喘小鼠炎性細胞因子表達的影響，探討阿奇霉素對肺部炎癥及細胞因子表達的影響，具體報道如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

阿奇霉素注射液（蘇州長征-欣凱制藥有限公司，生產批號：121128）;地塞米松磷酸鈉注射液（辰欣藥業(yè)股份有限公司，生產批號：1210206432）;雞卵白蛋白（OVA）（Ⅱ、Ⅴ級）（上海研生生化試劑有限公司）;DAB顯色試劑盒[生工生物工程（上海）有限分公司];多聚賴氨酸（北京格瑞納健峰生物技術有限公司）;大鼠IL-8、TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（美國R&D公司）;402Ai超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設備有限公司）;FA1004型微量電子天平（精度：0.1 mg，上海賽德利思精密儀器儀表有限公司）;QL-902漩渦混懸器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;AXTGL16M高速低溫離心機（上海趙迪實驗室儀器設備有限公司）;普通光學顯微鏡（蘇州耀宏光電科技有限公司）;Qwin550w型計算機病理圖像分析系統（德國LeicaQwin公司）。

1.2 實驗動物

6～8周齡的BALB/c小鼠共32只，雌性，體重20～25 g，購自濰坊醫(yī)學院（以下簡稱“我校”）實驗動物中心。清潔喂養(yǎng)，環(huán)境溫度控制在22～25℃，環(huán)境濕度控制在40%～70%，進水不限，喂養(yǎng)食物中不含OVA。本研究經我校動物試驗倫理委員會審核并予以批準。

1.3 方法

1.3.1 分組模型建立

32只小鼠采用隨機數字表法分為四組：A組，生理鹽水對照組;B組，哮喘組;C組，阿奇霉素干預組;D組，地塞米松干預組。每組8只小鼠。清潔級復制哮喘模型[6-8]：分別于第0、7、14天，予B、C、D組小鼠腹腔注射OVA 25 μg+Al（OH）3 1 mg。致敏1周后第21～26天，將小鼠置于透明玻璃容器中，2% OVA生理鹽水溶液霧化吸入。A組予等量生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。各組小鼠均每天激發(fā)1次，30 min/次，激發(fā)6 d。B組激發(fā)后未予任何藥物干預。C組于第14天起，霧化吸入1 h后皮下注射阿奇霉素0.4 mg/mL，連續(xù)7 d。D組于第14天起，霧化吸入1 h后皮下注射地塞米松磷酸鈉2 mg/kg，連續(xù)7 d。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 觀察各組小鼠肺組織病理表現 ?激發(fā)后24 h（第27天），處死小鼠，打開小鼠胸腔取右肺組織，10%中性甲醛固定，脫水、包埋，制作蠟塊，病理切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，100×光鏡下觀察肺組織結構。

1.3.2.2 觀察各組小鼠炎性細胞因子表達情況 ?激發(fā)后24 h（第27天），各組小鼠用37℃生理鹽水1 mL進行肺灌洗，反復3次，收集左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），采用ELISA法檢測IL-8、TNF-α、嗜酸性粒細胞計數及白細胞計數。試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠癥狀表現比較

B組小鼠于霧化激發(fā)時出現煩躁不安、抓耳撓腮、呼吸急促、打噴嚏、流涎、大小便失禁、腹肌強直等哮喘反應;而C組及D組霧化激發(fā)時上述反應均減輕;A組幾乎無任何反應。

2.2 各組小鼠肺組織病理表現比較

A組小鼠氣道黏膜無增厚，氣道周圍無炎癥細胞浸潤，肺泡壁結構完整;B組小鼠氣道黏膜充血水腫，氣道周圍較多炎癥細胞浸潤，肺泡結構被破壞;C組小鼠氣道周圍少量炎癥細胞浸潤，管壁無明顯增厚;D組小鼠程度與C組小鼠相似。見圖1（封四）。

2.3 各組小鼠BALF中白細胞總數和EOS百分比的比較

與A組比較，B組小鼠BALF中白細胞總數和EOS百分比均顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與B組比較，C組和D組小鼠BALF中白細胞總數及EOS百分比明顯降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。C、D兩組白細胞總數和EOS百分比比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.4 各組小鼠BALF中IL-8及TNF-α含量比較

與A組比較，B組IL-8及TNF-α含量顯著升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與B組比較，C組和D組IL-8及TNF-α含量顯著降低，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。C、D兩組IL-8及TNF-α含量比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

既往研究發(fā)現，在慢性哮喘患者和動物模型中均存在氣道上皮脫落、氣管周圍炎癥細胞浸潤、AHR等改變[9-12]。炎性細胞因子（如IL-8、TNF-α﹚是目前用于判斷氣道炎癥的主要指標。氣道炎癥被認為是哮喘的本質，T細胞在控制氣道炎性反應中起重要作用，Th1/Th2細胞比例失衡，Th2型細胞因子分泌增多在氣道炎癥的形成中發(fā)揮重要作用[2，13-14]。本研究發(fā)現：哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-8和TNF-α濃度均較正常對照組明顯降低。與既往研究[15-16]結果相符。

大環(huán)內酯類抗生素不但有抗菌作用，同時還具備非特異性的抗炎平喘、免疫調節(jié)、降低氣道高反應性、抑制黏液分泌及非抗菌的作用，尤其是對非特異呼吸道炎性反應，如彌散性細支氣管炎﹑哮喘等有顯著效果[16]。研究發(fā)現[17-18]，新大環(huán)內酯類抗生素如阿奇霉素，同時具有抗菌作用及抗炎免疫調節(jié)作用，能抑制多種炎性細胞因子和趨化因子的釋放，減少中性粒細胞的遷移和趨化，減少血液及痰液中EOS的數目及EOS陽離子蛋白的含量，抑制氣道杯狀細胞的過度分泌。研究發(fā)現[19-21]，阿奇霉素可以抑制Th17細胞分化，從而減少IL-17、IL-8、TNF-α等炎癥介質分泌，進而調節(jié)炎癥細胞浸潤，發(fā)揮抗炎作用。本研究結果顯示：阿奇霉素干預的小鼠BALF中白細胞總數和EOS百分比均較哮喘組顯著降低，肺組織氣道炎癥程度也較哮喘組明顯減輕，BALF中TNF-α和IL-8水平明顯降低，且這種作用與哮喘地塞米松比較，差異無統計學意義。結果提示，因阿奇霉素可發(fā)揮抗炎作用，抑制ASMCs的炎性反應，其抑制Th2細胞因子和改善炎癥的作用與地塞米松相似。

綜上所述，本研究發(fā)現阿奇霉素可以抑制IL-8、TNF-α的表達，阻礙Th2型細胞因子的生成，緩解氣道炎癥。

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