復(fù)方調(diào)理顆粒與單方混合臨床用量分析

文小燕 許國(guó)清 陳偉英 容麗英

月經(jīng)不調(diào)為婦科臨床實(shí)踐中常見癥狀，易導(dǎo)致婦女內(nèi)分泌紊亂、生育功能受損等狀況[1-3]。中醫(yī)經(jīng)典理論將該癥狀歸類為熱癥、血瘀、虛熱等，多以服用湯藥或中成藥調(diào)理為主，輔以食療或心理治療等手段[4-5]。復(fù)方調(diào)理顆粒系筆者所在單位基于經(jīng)典方開發(fā)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑，由白術(shù)、當(dāng)歸、巴戟天、黨參等藥味組成[6]。傳統(tǒng)湯劑采用中藥飲片煎水或單味藥配方顆?；旌蠜_調(diào)，便利性和質(zhì)量均一性較差[7-8]。復(fù)方調(diào)理顆粒將系各藥味在制劑室統(tǒng)一混合煎煮，制作規(guī)范、便利患者。為研究該制劑與傳統(tǒng)方法存在的差異，本研究擬建立科學(xué)、全面、適宜的檢測(cè)和評(píng)價(jià)方法。

1 儀器、試藥和材料

1.1 儀器

Waters 2695 高效液相色譜儀（美國(guó)），配備PDA 檢測(cè)器，昆山KQ3200 超聲儀（中國(guó)），Mettler-Toledo 精密電子分析天平（瑞士）。

1.2 試劑、試藥和材料

色譜分析所用甲醇、磷酸為色譜純，購(gòu)自Honeywell 公司（美國(guó)），實(shí)驗(yàn)用純凈水購(gòu)自Watsons 公司（中國(guó)）；白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)080100-201507）和藁本內(nèi)酯（批號(hào)101759-201206）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（中國(guó)）；單味藥配方顆粒購(gòu)自廣東一方制藥股份有限公司（中國(guó)），制備復(fù)方顆粒所用藥材購(gòu)自廣東康美藥業(yè)股份有限公司（中國(guó)）。復(fù)方調(diào)理顆粒為本單位自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品制備

復(fù)方顆粒供試品的制備方法為，取復(fù)方調(diào)理顆粒1.0 g，精密稱定，精密加水25 mL，稍加熱使溶解，所得溶液放冷后，加乙酸乙酯萃取兩次，每次20 mL；合并乙酸乙酯液，揮去溶劑，殘?jiān)芗尤爰状?5 mL使溶解，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

單味藥配方顆粒混合湯劑供試品制備方法為，取各處方量各藥味配方顆粒，加水400 mL 使溶解，精密量取所得溶液50 mL，自“加乙酸乙酯萃取”其制備供試品溶液，即得。

2.2 對(duì)照品制備

精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯對(duì)照品適量，置于同一10 mL 量瓶中，加甲醇適量溶解并定容至刻度，即得上述兩種對(duì)照品溶液含量均為500 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 色譜條件

使用Dikma C18 色譜柱（4.6×250 mm，5 μm），以甲醇（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（程序見表1），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。見表1。

表1 色譜條件表

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密吸取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液適量，分別置于不同10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得兩種對(duì)照品濃度均為10、20、50、100、200、500 μg/mL 的溶液。吸取上述溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)y，濃度為橫坐標(biāo)x，代入excel 軟件中進(jìn)行線性回歸。結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的回歸方程為y=1 141.7x-1 597.9（r2=0.999 8），藁本內(nèi)酯的回歸方程為y=2 224x -11 024（r2=0.999 2），表明方法線性關(guān)系良好，能夠在10-500 μg/ml 范圍內(nèi)對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.4.2 精密度考察 取供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析，記錄峰面積，計(jì)算RSD，結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯峰面積的RSD 分別為1.70%和0.47%，表明方法精密度良好。

2.4.3 提取回收率考察 取同一批復(fù)方調(diào)理顆粒（TL002）0.5g，按表3-1、3-2 所述最終濃度加入術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析，記錄白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算二者的含量、回收率和RSD。結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的平均回收率為101.07%，RSD 為2.82%；藁本內(nèi)酯的平均回收率為99.11%，RSD 為3.38%。結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于0、2、4、6、8、12 小時(shí)按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析，記錄白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算二者的含量和RSD。結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含量的RSD 為2.02%，藁本內(nèi)酯含量的RSD 為0.46%，表明本研究所制備供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.5 復(fù)方調(diào)理顆粒和單味藥材顆粒方劑的臨床用量比較研究

取10 批復(fù)方調(diào)理顆粒，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析；另取方中各藥味配方顆粒適量，共取10 劑，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)HPLC 分析；記錄上述溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和藁本內(nèi)酯峰面積，計(jì)算二者的含量和RSD。結(jié)果顯示（表3-1、3-2），復(fù)方顆粒中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的平均含量為0.325 mg/g；藁本內(nèi)酯的平均含量為0.817 mg/g。經(jīng)過(guò)等量換算，可知以白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ計(jì)，復(fù)方顆粒的臨床用量相當(dāng)于單味藥材配制湯劑的109.93%；以藁本內(nèi)酯計(jì)，復(fù)方顆粒的臨床用量相當(dāng)于單味藥材配制湯劑的94.86%。

3 討論

調(diào)理方的君藥為當(dāng)歸，臣藥為白術(shù)。傳統(tǒng)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑研究，除制劑檢查項(xiàng)外，對(duì)方中各藥味僅要求建立薄層色譜鑒別方法[9-10]。上述方法存在如下缺陷：一是僅包含鑒別項(xiàng)無(wú)法準(zhǔn)確反映方中各藥味特別是主要藥味（如君、臣藥）的含量差異，無(wú)從比較不同方法、不同批次藥材制備的湯劑之間的差異；二是湯劑本質(zhì)為以水為溶劑制備提取物，薄層色譜鑒別方法用于指標(biāo)的斑點(diǎn)可能并不是該藥味發(fā)揮功效主治的成分，不能準(zhǔn)確表征藥效。因此，在臨床用量研究中，指標(biāo)性成分應(yīng)包括上述兩種藥味中與功效主治相關(guān)的成分，同時(shí)應(yīng)建立基于儀器分析的上述指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法，用于準(zhǔn)確評(píng)價(jià)功效差異。文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ具有抗氧化和抗衰老的作用，能夠抑制細(xì)胞凋亡[11-13]；藁本內(nèi)酯為當(dāng)歸中的重要化學(xué)成分，除改善微循環(huán)，舒張血管作用外，也具有較好的抗氧化和抗衰老活性；同時(shí)，藁本內(nèi)酯對(duì)循環(huán)系統(tǒng)的調(diào)理，能夠較好地改善女性月經(jīng)不調(diào)的癥狀[14-15]。因此，選擇上述兩種成分作為指標(biāo)，較為貼近調(diào)理方的功效主治。

表2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ回收率測(cè)定結(jié)果

表3 藁本內(nèi)酯回收率測(cè)定結(jié)果

表3-1 復(fù)方和單方混合湯劑中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ轉(zhuǎn)移率

表3-2 復(fù)方和單方混合湯劑中藁本內(nèi)酯轉(zhuǎn)移率

本研究測(cè)定的兩個(gè)成分色譜峰周圍均存在其它色譜峰，經(jīng)過(guò)反復(fù)優(yōu)化，能夠基本實(shí)現(xiàn)基線分離。根據(jù)優(yōu)化過(guò)程中上述色譜峰間分離度、峰型和峰寬等參數(shù)推斷，這些成分可能是與目標(biāo)成分結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，且部分成分含量與目標(biāo)成分相近。上述結(jié)果提示，在調(diào)理方中，可能含有更多具有類似活性的成分。

根據(jù)臨床用量分析結(jié)果可知，復(fù)方調(diào)理顆粒與單味藥材配制的調(diào)理方湯劑相比較，其實(shí)際臨床用量并無(wú)顯著性差異（p＜0.05），表明復(fù)方調(diào)理顆?？梢栽谂R床應(yīng)用中替代配方顆粒所配制的方劑。此外，由于前者系復(fù)方顆粒，可以大大節(jié)省藥方配藥和患者沖服的難度，提高藥物的使用效率。同時(shí)，采用全方進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化提取和制粒，相較單味藥配方顆粒而言質(zhì)量更為可控，最終所得湯劑也較為穩(wěn)定。

本研究采用復(fù)方調(diào)理顆粒與單味藥配方顆粒配制的方劑進(jìn)行臨床用量比較研究，顯示前者對(duì)后者具有較好的替代性。所用分析方法快速、準(zhǔn)確、高效，能夠?yàn)楹罄m(xù)復(fù)方調(diào)理顆粒的開發(fā)提供研究經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)依據(jù)。