食管癌120例microRNA-24表達(dá)與放療敏感性的相關(guān)性分析

朱 勇，候 婧，魯正學(xué)，吳 蘭，李 燦

食管癌是消化道上皮組織源性惡性腫瘤，早期缺乏特異性癥狀，多數(shù)確診已處于中晚期，癥狀以進(jìn)行性吞咽困難為主。食管癌預(yù)后差，其5年生存率僅為30%[1]。放射療法是食管癌的重要治療手段，有研究表明不同患者對(duì)放療的抵抗性不同，療效存在顯著差異[2]。尋找敏感、特異的分子標(biāo)志物對(duì)食管癌放療效果進(jìn)行預(yù)測(cè)對(duì)制定個(gè)體化方案有重要臨床意義。已有報(bào)道指出microRNA(miRNA)可作為癌基因或抑癌基因，與腫瘤進(jìn)程有明顯關(guān)聯(lián)[3]。筆者對(duì)120例食管癌患者放療敏感性及相關(guān)性進(jìn)行分析對(duì)比，旨在為臨床治療提供借鑒。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017-05至2018-08我院放療科收治的120例食管癌患者，均為中晚期腫瘤患者，其中男75例，女45例，年齡60～78歲，平均(68.2±6.4)歲；鱗癌108例，腺癌12例，排除肝腎功能異常、免疫缺陷和其他惡性腫瘤等，均自愿接受放射治療，并同意本次研究。

1.2 放療方法 放射治療采用三維適形放療，模擬CT下勾畫靶區(qū)，臨床靶體積外0.5 cm為計(jì)劃靶體積，采用6MV-X照射治療，總劑量為60～70 Gy,1次/d，5d/周，連續(xù)治療6～7周。放射過程中出現(xiàn)放射性食管炎給予對(duì)癥治療。

1.3 檢測(cè)方法 放療前收集上述患者血清作為標(biāo)本?？崭钩槿⊥庵莒o脈血5 ml入不加抗凝劑的采血管中，標(biāo)本室溫靜置30 min后，于2 h內(nèi)以2000 r/min離心10 min，將2 ml血清移至EP管中，編號(hào)密封于-80 ℃冰箱中保存為后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備。

1.3.1 試劑和儀器 主要試劑：Trizol(美國Invitrogen)；All-in-OneTMmi RNA q RT-PCR Detection kit(美國 Gene Copoeia 公司)；DEPC 水(上海生工)；氯仿(中國國藥集團(tuán))；異丙醇(中國國藥集團(tuán))；無水乙醇(中國國藥集團(tuán))等。主要儀器：實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀 CFX96(美國 Bio-Rad 公司)；高速低溫離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；移液器(德國 Eppendorf 公司)；干浴恒溫器(其林貝爾)；-80 ℃冰箱(美國Thermo)。

1.3.2 PCR實(shí)驗(yàn)步驟 trizol法提取血清總RNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩步法反應(yīng)體系，設(shè)計(jì)miR-24引物，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，設(shè)置反應(yīng)程序(95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s)，利用PCR儀自帶軟件進(jìn)行分析，獲得并計(jì)算血清miR-24的Ct值。

1.4 療效標(biāo)準(zhǔn) 采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors ,RECIST)進(jìn)行評(píng)價(jià)。(1)完全緩解：所有病灶消失；(2)部分緩解：基線病灶長徑總和縮小≥30%；(3)穩(wěn)定：基線病灶長徑綜合縮小<30%，或增加<20%；(4)進(jìn)展：基線病灶長徑總和≥20%，或出現(xiàn)新病灶。將穩(wěn)定和進(jìn)展的患者視為放療抵抗組，將完全緩解和部分緩解視為放療敏感組。

1.6 結(jié)果

1.6.1 放療敏感性分組結(jié)果 依據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分組，120例中放療敏感組68例(完全緩解6例，部分緩解62例)，占56.67%，放療抵抗組52例(25例穩(wěn)定，27例進(jìn)展)，占43.33%。

1.6.2 兩組miR-24水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果提示：放療抵抗組放療前血清miR-24的Ct值高于放療敏感組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；放療后放療抵抗組血清miR-24的Ct值明顯高于放療敏感組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 兩組食管癌患者放療前后的血清miR-24的Ct值比較

2 討 論

放療是通過電離輻射產(chǎn)生自由基從而對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行殺傷的一種治療方法，國內(nèi)外研究認(rèn)為miRNA參與到了癌細(xì)胞細(xì)胞損傷當(dāng)中，可能作為放療的生物標(biāo)志物[4,5]。miRNA表達(dá)水平可能同腫瘤細(xì)胞的輻射劑量、輻照時(shí)間等有關(guān)，然后作用到靶基因，對(duì)下游蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究對(duì)食管癌患者進(jìn)行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)microRNA-296、microRNA-145、microRNA-17、microRNA-24等微小RNA均參與到DNA損傷修復(fù)中[6]。在腫瘤細(xì)胞中，通過miRNA水平改變調(diào)控細(xì)胞周期。

miRNA成為預(yù)測(cè)食管癌放療化療療效和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，也可能成為治療靶點(diǎn)[7-9]。Ct值是反映基因拷貝數(shù)的指標(biāo)，Ct值越高，基因拷貝數(shù)越低[10]，本文對(duì)我院放療科收治的120例食管癌患者的血清miRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，放療抵抗組放療前后血清miR-24的Ct值均明顯高于放療敏感組，說明放療抵抗組中的miR-24表達(dá)量較少，反之miR-24表達(dá)量越多的患者，對(duì)放射治療的敏感性可能就越好，治療效果可能就更佳。與文獻(xiàn)[11]研究發(fā)現(xiàn)miR-24通過作用于SP1能夠增強(qiáng)鼻咽癌的放療敏感性，結(jié)果基本一致。但食管癌患者存在放療差異性，具有不同程度的不良反應(yīng)，因此在放療前通過檢測(cè)miR-24的表達(dá)預(yù)測(cè)放療療效，有助于食管癌放療的個(gè)體化治療。

總之，miR-24的低表達(dá)可能與食管癌放療抵抗有關(guān)，下一步我們將繼續(xù)研究miR-24調(diào)節(jié)H2AX的信號(hào)通路機(jī)制，為miR-24預(yù)測(cè)食管癌放療效果并制定個(gè)體化方案提供證據(jù)。