miR-19a-3p靶向調(diào)控CCND1基因介導(dǎo)FrA-1/IL-6/Stat3信號(hào)通路對(duì)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制

陳秀迎，王洪遠(yuǎn)

乳腺癌主要誘發(fā)因素為惡變內(nèi)皮細(xì)胞增殖失控和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[1]。既往研究已對(duì)microRNA展開(kāi)深入研究，證實(shí)其既可發(fā)揮促癌作用亦存在抑癌作用[2]，且部分microRNA可同時(shí)兼具以上兩種作用[3]，在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生物學(xué)特性上具有顯著影響，因而在臨床診斷和腫瘤預(yù)測(cè)以及靶向治療方向作用明顯。大量研究已報(bào)道m(xù)icroRNA參與諸如頭頸部、消化道、泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤等[4-6]，但其分子機(jī)制仍未全可知。miR-19a-3p作為抑癌基因，在前列腺癌、胃癌等中有相關(guān)報(bào)道[7，8]。同時(shí)，細(xì)胞周期蛋白CCND1在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌中為陽(yáng)性表達(dá)[9，10]。鑒于此，本研究通過(guò)采集組織樣本和培養(yǎng)細(xì)胞系，基于與乳腺癌相關(guān)靶基因和信號(hào)通路的預(yù)測(cè)，探究miR-19a-3p靶向CCND1基因介導(dǎo)FrA-1/IL-6/Stat3通路對(duì)乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 收集日照市婦幼保健院病理科2017-01至2018-07女性乳腺癌標(biāo)本60例。年齡28～76歲，中位年齡56.2歲。所有樣本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。標(biāo)本離體后，一部分立即放入液氮冷凍，-80 ℃超低溫冰箱貯存?zhèn)溆茫涣硪徊糠止潭ㄓ?%中性甲醛溶液中，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片，保存?zhèn)溆?。采用蘇木精伊紅染色法(HE染色)觀察乳腺癌組織及癌旁組織的病理學(xué)變化。

1.1.2 細(xì)胞及培養(yǎng) 選取人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞株MCF7，均購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所。人乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A和乳腺癌細(xì)胞株MCF7均用含10%小牛血清、10 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，USA)培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)過(guò)程中觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并依據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行換液操作。

1.1.3 人乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)，采用胰蛋白酶消化細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按轉(zhuǎn)染物不同分為：空白組(空白處理)、陰性對(duì)照組(陰性質(zhì)粒)、siRNA-CCND1組(siRNA)、miR-19a-3p mimic組(mimic質(zhì)粒)、miR-19a-3p mimic+ siRNA-CCND1組(共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染物miR-19a-3p mimic， siRNA-CCND1質(zhì)粒均購(gòu)自上海吉瑪公司。

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索乳腺癌相關(guān)基因及信號(hào)通路 通過(guò)生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到乳腺癌相關(guān)基因及相關(guān)代謝通路，分別確定為CCND1基因和FrA-1/IL-6/Stat3通路。在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索CCND1的調(diào)控miRNA為miR-19a-3p。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 取乳腺癌組織和癌旁組織，加TRIzol(Invitrogen公司，USA)經(jīng)3000 r/min,離心10 min,取上清,提取總RNA；采用紫外光檢測(cè)RNA純度后將抽提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為PCR實(shí)驗(yàn)?zāi)０?，?duì)目的基因進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增；實(shí)時(shí)熒光定量PCR應(yīng)用AB7300型實(shí)時(shí)定量PCR儀器(購(gòu)于上海艾研生物科技有限公司，上海，中國(guó))。本實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參照基因。PCR擴(kuò)增完成后，通過(guò)比較Ct法統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此方法同樣適用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Western Blot檢測(cè) 待測(cè)組織加入冰上預(yù)冷的組織裂解液，置于冰上進(jìn)行裂解；Bradford法測(cè)定蛋白濃度；實(shí)驗(yàn)采用一抗為兔多克隆抗體CCND1、β-catenin、FrA-1；已標(biāo)記二抗。Western blot所用抗體均購(gòu)于abcam公司(劍橋，英國(guó))。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白表達(dá)(ECL試劑盒；購(gòu)于武漢博士德生物技術(shù)公司)。此方法同樣適用細(xì)胞蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。

1.2.4 MTT實(shí)驗(yàn) 按MTT常規(guī)操作程序，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)(培養(yǎng)觀察時(shí)間點(diǎn)為24 、48、96 h)，并依次加入各培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；并在培養(yǎng)結(jié)束前加入20 μl MTT溶液(Sigma公司，USA)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清并加入160 μl DMSO(Sigma公司，USA)。應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(濟(jì)南正榮醫(yī)療器械有限公司)測(cè)定各孔波長(zhǎng)490 nm處的吸光值(OD值)。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 按劃痕實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作程序，取合適細(xì)胞株制備單細(xì)胞懸液，接種操作置于CO2培養(yǎng)箱(揚(yáng)州恒都電子科技有限公司)常規(guī)培養(yǎng)24 h。之后應(yīng)用高壓滅菌槍頭在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板孔板中心軸處劃痕。繼續(xù)培養(yǎng)，采用倒置顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)觀察細(xì)胞情況并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)遷移率。按Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作程序，分別于小室加入相應(yīng)實(shí)驗(yàn)液，37 ℃下培養(yǎng)24 h、離心及結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并在實(shí)驗(yàn)后期進(jìn)行貼壁細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織HE染色結(jié)果 乳腺癌癌旁正常結(jié)締組織較多，成纖維細(xì)胞増生，纖維間質(zhì)稍有增生，但細(xì)胞無(wú)明顯異型性，分化較好；乳腺癌組織細(xì)胞排列混亂，癌細(xì)胞大量増生，癌巢中央可見(jiàn)大小各異的壞死、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞發(fā)生分化，核深染，核分裂象增多，有明顯核仁(圖1)。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織病理結(jié)果(HE，×100)

2.2 人乳腺癌組織和癌旁組織中FrA-1/IL-6/Stat3通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，人乳腺癌組織中CCND1、FrA-1的mRNA和蛋白表達(dá)均呈高表達(dá)，其表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)；而qRT-PCR提示人乳腺癌組織中miR-19a-3p表達(dá)水平顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 人乳腺癌組織和癌旁組織中相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平差異

2.3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平 qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，空白組與陰性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組和陰性對(duì)照組相比，另外3組的miR-19a-3p、CCND1、FrA-1表達(dá)水平均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1組中上調(diào)更為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2 乳腺癌各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平差異

2.4 miR-19a-3p靶向CCND1對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 MTT法觀察結(jié)果顯示，各組細(xì)胞在24 h時(shí)無(wú)明顯差異。48 h和96 h各組細(xì)胞增殖能力均提高?？瞻捉M與陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖能力相比無(wú)明顯差異。另外三組的細(xì)胞增殖能力均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但miR-19a-3p mimic + siRNA-CCND1組中細(xì)胞增殖變化趨勢(shì)較弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

2.5 miR-19a-3p靶向CCND1對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 空白組與陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移、侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組和陰性對(duì)照組相比，另外三組細(xì)胞遷移、侵襲能力均減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且miR-19a-3p mimic+siRNA-CCND1組遷移、侵襲能力最弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

表3 miR-19a-3p靶向CCND1對(duì)乳腺癌各組細(xì)胞增殖能力變化的影響

表4 miR-19a-3p靶向CCND1對(duì)乳腺癌各組細(xì)胞遷移和侵襲能力變化的影響

3 討 論

Kong等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-27a可通過(guò)負(fù)向調(diào)控SFRP1基因，激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖遷移等。Imani S等[12]亦報(bào)道m(xù)iR-34a靶向EMT-TFs，抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究選取高度保守microRNA，miR-19a-3p首先推斷其可能具有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。根據(jù)前期臨床標(biāo)本的PCR和Western blot證明了我們的初步假設(shè)；同時(shí)，CCND1基因是近年來(lái)已確認(rèn)的癌基因，與人類(lèi)腫瘤關(guān)系密切[13，14]，且已證實(shí)在乳腺癌中異常表達(dá)[15]。為進(jìn)一步確認(rèn)其上下游作用機(jī)制，本研究通過(guò)人體組織樣本和細(xì)胞系培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p乳腺癌中表達(dá)下降，CCND1和Fra-1表達(dá)則呈上升趨勢(shì)；進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上升miR-19a-3p可有效抑制CCND1表達(dá)和Fra-1表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果這一關(guān)聯(lián)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，提示miR-19a-3p可能通過(guò)靶向抑制CCND1，調(diào)控FrA-1/IL-6/Stat3信號(hào)通路，抑制FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，伴隨體外乳腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中侵襲轉(zhuǎn)移能力的下降，從腫瘤微環(huán)境上影響癌細(xì)胞發(fā)展進(jìn)程。文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-19a-3p有助于通過(guò)激活TGF-β信號(hào)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移和骨轉(zhuǎn)移；張智勇等[8]發(fā)現(xiàn)miR-19a-3p可下降SEMA4C表達(dá)從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲。類(lèi)似研究進(jìn)一步支持本文假設(shè)推理，有助于通過(guò)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染探究乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機(jī)制，為乳腺癌分子靶向治療提供潛在實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

FrA-1/IL-6/Stat3信號(hào)通路是影響腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表型的主要通路之一，后者在腫瘤微環(huán)境中有巨大的潛能[17，18]。巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的異質(zhì)性和可塑性。在惡性競(jìng)爭(zhēng)的腫瘤微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞可形成其獨(dú)特表型，從而發(fā)揮促癌作用。本研究通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以miR-19a-3p表達(dá)上升，抑制FrA-1表達(dá)。FrA-1已證實(shí)是一類(lèi)原癌基因，在包括乳腺癌在內(nèi)的眾多癌癥中異常表達(dá)[19]。提示其可作為乳腺癌靶向治療的重要靶點(diǎn)。我們推測(cè)FrA-1表達(dá)沉默可能進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞表型，干擾血管新生的形成，抑制下有信號(hào)通路，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞增殖等行為的改變。

總之，本研究創(chuàng)新之處在于通過(guò)借助生物信息學(xué)技術(shù)和分子生物學(xué)方法，尋找潛在癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，確認(rèn)miR-19a-3p可抑制CCND1基因表達(dá)和FrA-1/IL-6/Stat3通路激活，降低乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。下一步研究可借助生物信息學(xué)技術(shù)，系統(tǒng)篩選其他與乳腺癌相關(guān)的信號(hào)通路和靶基因，并通過(guò)體內(nèi)外研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究靶基因相關(guān)眾多microRNAs的作用和功能，從而為乳腺癌靶向治療提供全面的分子生物學(xué)證據(jù)。