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    調(diào)胃承氣湯對腸源性膿毒癥大鼠免疫功能的影響

    2019-09-07 07:55:51趙鋒利王澍欣羅苑苑鄭述銘陳靜趙馥冼紹祥
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2019年17期
    關(guān)鍵詞:免疫功能淋巴細胞

    趙鋒利 王澍欣 羅苑苑 鄭述銘 陳靜 趙馥 冼紹祥

    [摘要] 目的 觀察調(diào)胃承氣湯(TWCQ)對腸源性膿毒癥大鼠免疫功能的影響。 方法 將60只SPF級雄性SD大鼠按體重隨機分為假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組(30 000 U/kg)、TWCQ灌胃組(9.45 g生藥/kg)、TWCQ灌腸組(9.45 g生藥/kg)和TWCQ灌腸+烏司他丁組(n = 8),在造模后2、10、24 h分別給藥,烏司他丁經(jīng)腹腔注射給藥,TWCQ根據(jù)組別分別通過灌胃途徑和灌腸途徑給藥,在24 h結(jié)束實驗。用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測血清中白細胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平,流式細胞儀檢測小腸系膜中CD4+和CD8+T淋巴細胞水平,并在光鏡下觀察小腸HE染色結(jié)果。 結(jié)果 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠小腸系膜中CD4+/CD8+T淋巴細胞數(shù)的比例明顯下降(P < 0.05),血清IL-10水平降低,TNF-α水平升高(P < 0.05),小腸可見明顯的病理性損傷;與模型組比較,TWCQ治療組大鼠小腸系膜中CD4+/CD8+T淋巴細胞數(shù)的比例明顯上升(P < 0.05),血清IL-10水平升高,TNF-α水平降低(P < 0.05),并且模型小腸的損傷程度明顯改善;與TWCQ灌胃組比較,TWCQ灌腸組的治療效果更為明顯(P < 0.05)。 結(jié)論 TWCQ具有改善腸源性膿毒癥大鼠模型CD4+/CD8+T淋巴細胞比例、降低免疫炎癥的功能,且灌腸療法要優(yōu)于灌胃療法。

    [關(guān)鍵詞] 調(diào)胃承氣湯;腸源性膿毒癥;免疫功能;淋巴細胞

    [中圖分類號] R631.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210(2019)06(b)-0018-05

    Influence of Tiaowei Chengqi Decoction on the immunologic function of rats with gut-derived sepsis

    ZHAO Fengli1? ?WANG Shuxin2? ?LUO Yuanyuan1? ?ZHENG Shuming1? ?CHEN Jing1? ?ZHAO Fu1? ?XIAN Shaoxiang3

    1.Intensive Care Unit, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou? ?510405, China; 2.Acupuncture Department, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou? ?510405, China; 3.the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangdong Province, Guangzhou? ?510405, China

    [Abstract] Objective To observe the influence of Tiaowei Chengqi Decoction (TWCQ) on the immunologic function of rats with gut-derived sepsis. Methods Sixty SPF male SD rats were randomly divided into sham operation group, model group, Ulinastatin group (30 000 U/kg), TWCQ gavage group (9.45 g/kg), TWCQ enema group (9.45 g/kg) and TWCQ enema + Ulinastatine group according to their body weight (n = 8). After modeling for 2, 10, 24 h, Ulinastatine was administered by intraperitoneal injection, respectively. TWCQ was administered by gastric way and enema way respectively according to different groups, and the experiment was completed at 24 hours. The levels of serum interleukin 10 (IL-10) and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), the levels of CD4+ and CD8+ T lymphocyte in mesentery of small intestine were detected by flow cytometry, and the results of HE staining in small intestine were observed under light microscope. Results Compared with sham operation group, the proportion of CD4+/CD8+ T lymphocyte in mesentery of small intestine in rats of model group was decreased significantly (P < 0.05), the level of IL-10 was reduced and TNF-α was improved significantly (P < 0.05), and the pathological damage of small intestine could be seen obviously. Compared with model group, the proportion of CD4+/CD8+ T lymphocyte in mesentery of small intestine in rats of TWCQ treatment group increased significantly (P < 0.05), the level of IL-10 was improved and TNF-α was reduced significantly (P < 0.05), and the damage degree of model small intestine was improved obviously. Compared with TWCQ gavage group, the therapeutic effect of TWCQ enema group was more obvious (P < 0.05). Conclusion TWCQ has the function of improving the proportion of CD4+/CD8+ T lymphocyte and reducing immunologic function in model rats with gut-derived sepsis, and enema therapy is superior to gavage therapy.

    [Key words] Tiaowei Chengqi Decoction; Gut-derived sepsis; Immunologic function; Lymphocyte

    腸源性膿毒癥是一種由腸道感染引發(fā)的全身性反應(yīng),主要包括引起宿主免疫功能失調(diào),并最終導(dǎo)致多器官功能障礙[1]。腸源性膿毒癥是ICU常見的危重病,其病情發(fā)展迅速,臨床救治難度大,每年全世界患病人數(shù)超過數(shù)百萬,病死率已超過膿毒癥患者數(shù)量的四分之一,并且這一數(shù)據(jù)逐年上升[2-3]。腸源性膿毒癥的發(fā)病機制主要包括腸黏膜機械屏障破壞、自身抵抗力下降及腸道微生態(tài)環(huán)境失衡[4-6]。盡管腸源性膿毒癥的致病因素是多方面的,但機體對腸源性膿毒癥的免疫反應(yīng)將決定病情的走向,并且,過度而持久的炎性反應(yīng)嚴重降低機體免疫功能,進一步加重病情[7-8]。同時,由于腸黏膜的破壞,經(jīng)灌胃給藥途徑的藥物生物利用度降低,而直腸黏膜血流豐富,利于藥物的吸收,臨床上常采用灌腸給藥來提高療效[9]。本研究通過大鼠盲腸結(jié)扎穿刺法(cecum ligation puncture,CLP)復(fù)制腸源性膿毒癥大鼠模型,觀察調(diào)胃承氣湯(TWCQ)灌胃與灌腸療法對模型大鼠的血清白細胞介素10(IL-10)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)炎癥水平的影響,并應(yīng)用流式細胞術(shù)觀察TWCQ對該疾病模型的免疫調(diào)節(jié)作用,從而探討該中藥湯劑對腸源性膿毒癥大鼠腸黏膜的影響,解決膿毒癥腸功能障礙的難題。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑

    大黃(130908261)、芒硝(130707541)和炙甘草(130713191)均購自康美藥業(yè)股份有限公司:烏司他?。ㄉ唐访禾炱章灏玻瑥V東天普生化醫(yī)藥股份有限司,批號:031609203,10萬U)。大鼠TNF-α(569180 115)和IL-10(385r1229)酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒均購自天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司;Anti-CD4-FITC(BioLegend,貨號:201505);Anti-CD8-PE(Biolegend,貨號:201712);APC CD3 Antibody(Biolegend,貨號:201413)。

    1.2 儀器

    Varioskan Flash型全波長多功能酶標儀(美國Thermo公司);Cytomics FC500 MPL流式細胞儀(Beckman Coulter,Inc);5450型小型高速離心機(德國Eppendorf公司);L-600臺式大容量低速離心機(上海利鑫堅離心機有限公司);JJ500型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠);BSA2245型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

    1.3 實驗動物

    48只SPF級雄性SD大鼠,體重280~320 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2013-0002,實驗動物質(zhì)量合格證號為440 07200047550。動物實驗環(huán)境:廣東省中醫(yī)研究所SPF級動物實驗室,設(shè)施使用許可證號為SYXK(粵)2010-0059。

    1.4 分組與給藥

    將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、烏司他丁組、TWCQ灌胃組、TWCQ灌腸組及TWCQ灌腸+烏司他丁組,每組8只。烏司他丁組(30 000 U/kg)以腹腔注射方式(3 mL/kg)給藥,TWCQ灌胃組以灌胃方式(10 mL/kg)給藥,TWCQ灌腸組通過直腸灌腸方式(3 mL/kg)給藥,假手術(shù)組與模型組以灌胃方式給予等量生理鹽水。TWCQ的臨床處方量為105 g(大黃60 g、甘草30 g、芒硝15 g),以此臨床用量為基礎(chǔ),換算得出大鼠臨床給藥劑量(9.45 g生藥/kg)。在術(shù)后造模2、10、24 h分別給藥,并在第3個時間點給藥1 h后結(jié)束實驗。

    1.5 模型復(fù)制

    采用CLP方法復(fù)制腸源性膿毒癥大鼠模型[10]。實驗前所有大鼠禁食12 h,用10%水合氯醛麻醉大鼠后,沿腹中線剪開約2 cm開口,小心取出盲腸置于用75%酒精消毒的紗布上,而后將糞便趕至盲腸尾端,用傳統(tǒng)代號為1號的醫(yī)用真絲編織線結(jié)扎盲腸50%,往盲腸尾端注射1 mL生理鹽水稀釋糞便,而后用針頭穿孔3次,輕輕擠壓盲腸使糞便流出后將盲腸小心放回腹腔。逐層縫合切口,腹腔注射37℃恒溫生理鹽水5 mL,使大鼠生理復(fù)蘇。假手術(shù)組除不做盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)外,其余同模型組。

    1.6 血清相關(guān)指標檢測

    10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,從腹主動脈收集3 mL血液,以3000 r/min、12.42 cm離心半徑離心10 min后,取血清于-80℃凍存。按照ELISA說明書檢測血清中IL-10和TNF-α炎癥水平。

    1.7 淋巴細胞懸液制備與流式細胞儀檢測

    無菌取小腸系膜上的淋巴結(jié),剪碎研磨,用預(yù)冷的PBS 緩沖液洗滌細胞2次,以12 000 r/min、8.4 cm離心半徑離心10 min,棄掉上清液,調(diào)整淋巴細胞懸液濃度為1×107個/mL。取淋巴細胞懸液100 μL,按照試劑盒說明分別加入熒光素標記的CD3 0.5 μL、CD4和CD8單克隆抗體各1 μL,避光4℃孵育30 min,加入預(yù)冷PBS 1 mL重懸細胞,2400 r/min離心5 min,棄上清,細胞沉淀重懸于500 μL緩沖液,而后上機檢測,并分析大鼠小腸系膜CD4+T細胞/淋巴細胞、CD8+T細胞/淋巴細胞、CD4+/CD8+T細胞的百分比。

    1.8 HE染色

    將小腸除去組織周圍的脂肪及結(jié)締組織,生理鹽水沖洗后,用10%甲醛固定組織,隨后依次使用乙醇濃度梯度法脫水,將脫水后的組織浸入二甲苯,待組織呈透明狀時,停止二甲苯浸泡。隨后,將組織進行包埋、切片和烘干。經(jīng)二甲苯脫蠟后,用乙醇梯度法洗去二甲苯。之后進行蘇木精-伊紅染色,隨后用乙醇脫水,二甲苯透明,最后用中性樹脂封片并觀察。

    1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

    所有數(shù)據(jù)由SPSS 22.0軟件完成。計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示,多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間均數(shù)兩兩比較,方差齊時采用SNK法,方差不齊時采用Dunnett′s T3法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 TNF-α和IL-10炎癥水平

    與假手術(shù)組比較,模型組中TNF-α水平明顯上升,IL-10水平明顯下降,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01):與模型組比較,烏司他丁組、TWCQ治療組(包括TWCQ灌胃組、TWCQ灌腸組及TWCQ灌腸+烏司他丁組,下同)中的TNF-α水平均顯著下調(diào)(P < 0.01),IL-10水平均顯著上調(diào)(P < 0.05或P < 0.01);與TWCQ灌胃組比較,烏司他丁組、TWCQ灌腸組以及TWCQ灌腸+烏司他丁組血清中TNF-α水平均明顯降低,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01),但TWCQ灌腸組中IL-10水平要高于TWCQ灌胃組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)。見圖1。

    2.2 流式細胞技術(shù)檢測結(jié)果

    本實驗采用標記有特異熒光的3種抗體CD3、CD4和CD8檢測腸系膜淋巴結(jié)淋巴細胞的百分比。從流式細胞儀結(jié)果可以看出,與假手術(shù)組比較,模型組小腸系膜組織中的CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量均減少,CD4+/CD8+T淋巴細胞比例顯著下降,差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。與模型組比較,TWCQ治療組的CD4+和CD8+T淋巴細胞數(shù)量均明顯上升(P < 0.01),且CD4+/CD8+T淋巴細胞比例均顯著回升,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01);與TWCQ灌胃組比較,烏司他丁組、TWCQ灌腸組和TWCQ灌腸+烏司他丁組CD4+/CD8+T淋巴細胞比例均明顯升高,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.01)。見表1、圖2。

    表1? ?各組CD4+、CD8+和CD4+/CD8+T淋巴細胞的比較(x±s,n = 8)

    注:與假手術(shù)組比較,**P < 0.01;與模型組比較,##P < 0.01;與TWCQ灌胃組比較,▽▽P < 0.01。TWCQ:調(diào)胃承氣湯

    2.3 病理結(jié)果

    在假手術(shù)組中,大鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)基本正常,絨毛結(jié)構(gòu)基本完整,且沒有炎性組織浸潤。在模型組中,可見絨毛壞死現(xiàn)象,黏膜間隙增大,固有層萎縮,炎性組織浸潤嚴重。在烏司他丁組中,絨毛的損傷有一定程度的恢復(fù),固有層基本完整,黏膜間隙較小,炎性組織浸潤相對減少。在TWCQ治療組中,TWCQ灌胃組絨毛結(jié)構(gòu)破壞的部分有一定程度的恢復(fù),固有層完整,黏膜間隙較小,炎性組織浸潤相對減少;TWCQ灌腸組及TWCQ灌腸+烏司他丁組中絨毛結(jié)構(gòu)均相對完整,黏膜間隙部分擴大,炎性組織浸潤相對減少。從結(jié)果可知,TWCQ治療組均能明顯改善由腸源性膿毒癥引起的小腸病理性變化,TWCQ灌腸組及TWCQ灌腸+烏司他丁組對小腸病理改善的程度更明顯。見圖3。

    3 討論

    腸道是膿毒癥所致?lián)p傷最早受累的器官之一,腸黏膜屏障的破壞及其通透性的改變將導(dǎo)致菌群移位到其他器官組織,隨后導(dǎo)致膿毒癥及多器官功能障礙綜合征(MODS)[11-12],但隨后細菌的生存狀態(tài)將取決于機體免疫功能的強弱。因此,腸道作為機體最大的免疫器官之一,調(diào)節(jié)其免疫功能可以有效地防治腸源性膿毒癥[13]。

    傳統(tǒng)中醫(yī)理論認為,膿毒癥屬于傷寒、溫病范疇,毒邪內(nèi)蘊是其重要發(fā)病基礎(chǔ),臨床上相對應(yīng)的有清熱解毒、通腑降下及活血化瘀等治則[14]。TWCQ出自《傷寒論》,主要由大黃、芒硝、炙甘草三味藥組成[15],具有瀉熱和胃、潤燥軟堅的功效,對于膿毒癥腸功能障礙時毒熱內(nèi)盛、瘀毒內(nèi)阻證型有非常好的效果[16]?,F(xiàn)代藥理研究表明,TWCQ具有顯著的抗炎及抗變態(tài)反應(yīng)作用,能有效降低由內(nèi)毒素引起的炎癥水平,調(diào)節(jié)機體免疫功能,還能對腸黏膜引起沒有損傷性的化學(xué)和機械刺激效應(yīng),從而促進腸蠕動[17-19]。

    由于該疾病的特殊性,臨床觀察發(fā)現(xiàn)灌胃給藥的療效沒有預(yù)期中理想,而灌腸給藥的方式療效顯著[20-22],同時也能解決ICU危重癥患者經(jīng)常不能口服給藥的不足。據(jù)文獻研究,藥物通過直腸途徑給藥,腸道黏膜可以直接將其吸收入血,并且可以避免肝臟首過清除效應(yīng),因而外周血藥物濃度達到峰值的時間和峰值高度都較口服方式有較大的提高[23-24],提高了藥物的吸收利用率。

    本研究發(fā)現(xiàn),在TWCQ干預(yù)后的腸系膜淋巴細胞中,CD4+/CD8+T淋巴細胞平衡得以改善,且血清中IL-10含量升高,TNF-α水平下降,提示TWCQ能調(diào)節(jié)Th1/Th2淋巴細胞比例的平衡,從而調(diào)控抗炎和促炎因子的釋放,增加對移位細菌的滅殺,改善腸源性膿毒癥:并且,本研究探討了TWCQ兩種不同給藥途徑,發(fā)現(xiàn)灌腸療法較之灌胃療法能更明顯地降低免疫炎癥。同時,基于TWCQ能有效地發(fā)揮抗炎作用,本研究下一步將探究在TWCQ灌腸干預(yù)后機體內(nèi)腸道黏膜屏障的完整性,從而對細菌移位的必要條件進行充分的研究,以期完善TWCQ治療腸源性膿毒癥的作用機制,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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