二甲雙胍對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠炎性狀態(tài)的影響

張國(guó)正，連 榮，苗文杰，余文發(fā)

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，河南 衛(wèi)輝 453100)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是指機(jī)體在接觸特定變應(yīng)原以后由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，臨床表現(xiàn)多以鼻塞、流涕、噴嚏和鼻癢為主[1]。AR發(fā)病機(jī)制多認(rèn)為是由輔助性T細(xì)胞1(T-helper 1，Th1)/輔助性T細(xì)胞2(T-helper 2，Th2)免疫失衡紊亂導(dǎo)致，即Th2細(xì)胞過度極化及其相應(yīng)的炎性因子過度分泌誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]。但有研究認(rèn)為，Th17細(xì)胞在AR的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用，白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)作為Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子之一，對(duì)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在局部炎癥部位的募集具有強(qiáng)大的促進(jìn)作用，從而導(dǎo)致局部慢性炎性狀態(tài)[3-4]。IL-17參與多種呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病，呂文漪等[5]研究認(rèn)為，IL-17在哮喘患者血清和痰液中的表達(dá)水平顯著升高，主要與呼吸道高反應(yīng)性的炎癥程度密切相關(guān)；劉春苗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，變應(yīng)原為塵螨的AR患者血清IL-17表達(dá)水平明顯升高，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。IL-17主要通過活化蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(janus protein tyrosine kinase/signal transducers and activators of transcription，JAK/STAT)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用，而STAT3是JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最為關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子之一，活性形式為磷酸化STAT3(phosphorylation of signal transducers and activators of transcription 3，p-STAT3)，其在AR患者鼻黏膜局部免疫調(diào)節(jié)中具有重要的生物學(xué)作用[7]。二甲雙胍是一種臨床廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病的降糖藥，但最近研究認(rèn)為，二甲雙胍可特異性抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而降低IL-17表達(dá)[8-9]。結(jié)合上述文獻(xiàn)報(bào)道，考慮二甲雙胍對(duì)于AR具有潛在的治療作用，因此，本研究通過構(gòu)建卵清蛋白誘導(dǎo)的AR小鼠模型，觀察二甲雙胍對(duì)AR模型小鼠炎性狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雄性無特定病原體級(jí)BALB/c小鼠30只，購(gòu)自河南新鄉(xiāng)華蘭生物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：201801130025，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2015-0001]，體質(zhì)量18～20 g，在室溫(24±1) ℃及明、暗各12 h的條件下自由取食(高壓蒸汽滅菌用水及正常飼料喂養(yǎng))。

1.2 主要試劑與儀器二甲雙胍粉劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，抗IL-17兔抗、抗p-STAT3兔抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，鼠血清IL-17和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，鼠血清IL-6檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fsiher Scientific公司，Amersham Imager600凝膠系統(tǒng)成像儀購(gòu)自日本GE Healthcare公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理將30只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和二甲雙胍組，每組10只。將100 μg卵清蛋白聯(lián)合2 mg AL(OH)3溶于0.1 mL 生理鹽水中，造模的第1、3、5、7、9、11、13、15天對(duì)模型組和二甲雙胍組小鼠進(jìn)行腹腔注射，每日1次，每次0.1 mL;第16天開始將500 μg卵清蛋白溶于10 μL生理鹽水中，對(duì)模型組和二甲雙胍組小鼠進(jìn)行滴鼻，每鼻孔10 μL，每日1次，連續(xù)激發(fā)11 d。二甲雙胍組小鼠在造模同時(shí)每天給予150 g·L-1二甲雙胍溶液0.3 mL腹腔注射，連續(xù)25 d。對(duì)照組小鼠每日給予生理鹽水腹腔注射,每日1次，每次0.4 mL，連續(xù) 25 d；生理鹽水滴鼻，每日1次，每次10 μL，連續(xù)11 d。

1.3.2 各組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平測(cè)定造模成功后，各組小鼠經(jīng)眼球取血2～5 mL，常溫下離心收集上層血清并置于-80 ℃冰箱中保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3 Western blot法檢測(cè)各組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3的表達(dá)造模成功后，眼球取血備用，采用斷頸法處死小鼠，并取鼻黏膜組織，置于高溫滅菌且經(jīng)液氮預(yù)冷后的研缽中，加入液氮研磨成粉末后移入1.5 mL的EP管，加入500 μL含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)和蛋白酶抑制劑的放射免疫測(cè)定(radioimmuno-precipi-tation assay，RIPA)裂解液，冰上孵育約30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液至新的EP管進(jìn)行分裝，-80 ℃冰箱中保存。配置上層和下層膠并插入梳子,待膠凝固后加入5 μL蛋白樣品和Marker，加樣進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，剪相應(yīng)大小的聚偏二氟乙烯膜，加入電轉(zhuǎn)液中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，牛奶封閉，加入一抗 IL-17(11 000)抗體、p-STAT3(11 000)抗體、β-actin (11 000) 4 ℃孵育過夜，洗膜后加入二抗(11 000)孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)目的條帶的灰度值，蛋白表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α表達(dá)水平比較結(jié)果見表1。二甲雙胍組和模型組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；二甲雙胍組小鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組小鼠血清炎性因子水平比較

組別nIL-17/(ng·L-1)IL-6/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)對(duì)照組1017.18±3.072.67±0.62133.98±5.34模型組1056.34±6.29a12.87±1.46a287.18±10.11a二甲雙胍組1036.72±2.55ab8.28±0.92ab248.54±20.65ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.2 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見圖1和表2。二甲雙胍組和模型組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);二甲雙胍組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：模型組；2：二甲雙胍組；3：對(duì)照組。

圖1 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白的表達(dá) (Western blot)

Fig.1 Expression of IL-17 and p-STAT3 protein in nasal mucosa of mice in the three groups (Western blot)

表2 3組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和p-STAT3蛋白表達(dá)比較

組別nIL-17p-STAT3對(duì)照組100.13±0.020.05±0.01模型組101.10±0.14a1.36±0.23a二甲雙胍組100.43±0.02ab0.28±0.01ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

3 討論

二甲雙胍作為一種常用的雙胍類降糖藥已在臨床上使用多年，但最近多項(xiàng)研究認(rèn)為，二甲雙胍除了降糖作用外，還具有抗炎、調(diào)節(jié)腸道菌群、保護(hù)神經(jīng)功能、抑制角質(zhì)形成細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞過度增殖等作用[8-12]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-17能通過JAK/STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，IL-17也可激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidy-linositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號(hào)通路，促進(jìn)炎性因子IL-6和TNF-α的釋放，而二甲雙胍可通過抑制JAK/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而抑制腫瘤細(xì)胞再生[8-9]。IL-17作為一種重要的炎性因子參與眾多變態(tài)反應(yīng)性疾病，宋輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AR小鼠黏膜組織中IL-17 mRNA表達(dá)水平顯著升高，故而參考既往文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[6,13]，作者認(rèn)為 IL-17的高表達(dá)在AR的發(fā)病機(jī)制中可能具有顯著作用，同時(shí)，關(guān)于二甲雙胍和AR相關(guān)性研究報(bào)道較少，因此，本研究采用卵清蛋白構(gòu)建AR小鼠模型，探討二甲雙胍干預(yù)對(duì)AR小鼠炎性狀態(tài)的影響。

前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，僅150 g·L-1二甲雙胍溶液0.3 mL腹腔注射時(shí)，3組小鼠血糖水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究最終選擇 150 g·L-1二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)處理。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍組小鼠鼻黏膜組織中IL-17和 p-STAT3 蛋白表達(dá)水平顯著低于模型組，但高于對(duì)照組；提示二甲雙胍對(duì)AR可能具有一定的治療作用，其機(jī)制可能與抑制p-STAT3和IL-17的蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可明顯抑制血清IL-17、IL-6和TNF-α水平，提示二甲雙胍也可減輕AR小鼠的炎癥狀態(tài)。葛安琪等[14]采用二甲雙胍對(duì)骨癌痛模型小鼠干預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，小鼠脊髓背角中p-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低；楊明峰等[15]采用二甲雙胍對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠干預(yù)處理后也發(fā)現(xiàn)大鼠脾臟Th17細(xì)胞和IL-17表達(dá)顯著降低；以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，間接證實(shí)二甲雙胍能抑制p-STAT3和IL-17的表達(dá)。

綜上所述，二甲雙胍在一定程度上可減輕AR模型小鼠鼻黏膜組織的炎癥狀態(tài)，并降低外周血炎性因子的表達(dá)水平，其機(jī)制可能與抑制p-STAT3蛋白表達(dá)有關(guān)，本研究為今后實(shí)現(xiàn)STAT3單克隆抗體治療AR提供理論依據(jù)。本研究未探討在沉默STAT3基因的情況下采用二甲雙胍干預(yù)后各炎性因子的變化，下一步應(yīng)當(dāng)獲取AR患者鼻黏膜組織及外周血，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究中的相關(guān)指標(biāo)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致。