環(huán)黃芪醇對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

王 位，馬續(xù)祥，陳衛(wèi)東

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽 蚌埠 233000)

急性腎損傷是指腎功能在短時(shí)間內(nèi)喪失，腎小管過(guò)濾功能降低，引起尿素和其他氮質(zhì)代謝產(chǎn)物潴留、體內(nèi)電解質(zhì)紊亂的臨床常見(jiàn)危重病[1]。急性腎損傷的病理生理學(xué)機(jī)制一般包括白細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性因子產(chǎn)生與釋放及自由基氧化等過(guò)程[2-3]。由于缺乏有效的治療手段，急性腎損傷常常進(jìn)展為慢性腎臟疾病，對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，且發(fā)病率與病死率較高。近年來(lái)，藥物引起的急、慢性腎衰竭日益增多，腎毒性藥物已成為導(dǎo)致急性腎損傷的重要病因之一，探尋預(yù)防和治療急性腎損傷的藥物具有重要意義。黃芪為豆科植物膜莢黃芪、蒙古黃芪等的干燥根，是傳統(tǒng)補(bǔ)氣中藥，具有補(bǔ)氣健脾、升陽(yáng)固表等功效[4]。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可以改善急性腎損傷，對(duì)腎功能有保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確[5]。環(huán)黃芪醇是從黃芪中提取的一種環(huán)菠蘿烷型四環(huán)三萜類(lèi)化合物，是黃芪藥理作用的重要成分，具有增強(qiáng)機(jī)體清除氧自由基能力、抑制過(guò)氧化反應(yīng)等功效。研究表明，環(huán)黃芪醇通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的過(guò)量產(chǎn)生，從而預(yù)防由醫(yī)源性高胰島素血癥引起的腎損傷，說(shuō)明環(huán)黃芪醇對(duì)腎損傷可以發(fā)揮保護(hù)作用[6-7]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。本研究利用慶大霉素構(gòu)建小鼠急性腎損傷模型，并采用梯度濃度環(huán)黃芪醇進(jìn)行治療，旨在探討環(huán)黃芪醇對(duì)急性腎損傷小鼠腎功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8周齡雄性C57BL/6J小鼠30只，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：34000200001224。30只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組，每組6只。小鼠于無(wú)特定病原體級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h明暗交替，環(huán)境溫度20～24 ℃，濕度45%～55%，自由攝食和飲水。本實(shí)驗(yàn)及相關(guān)操作均經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器環(huán)黃芪醇購(gòu)自西安優(yōu)碩生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原性谷胱甘肽(glutataione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、肌酐(creatinine，CRE)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，多聚甲醛、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑、過(guò)碘酸希夫(periodic acid-schiff，PAS)染色試劑購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，乙醇、二甲苯購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，放射免疫沉淀(radio-immunoprecipitation,RIPA)裂解液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)購(gòu)自博士德生物工程有限公司；SpectraMax190 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD公司，5415R高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、脫水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olypus公司。

1.3 小鼠急性腎損傷模型制備模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腹腔注射適量慶大霉素(100 mg·kg-1)，每日1次，連續(xù)7 d；同時(shí)，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠分別按200、400、800 mg·kg-1的劑量給予環(huán)黃芪醇灌胃，每日1次，連續(xù)7 d；空白組和模型組小鼠灌胃等量生理鹽水。各組小鼠均于造模第7天給藥后當(dāng)晚禁食、水，造模第8日經(jīng)眶內(nèi)靜脈采血，然后采用頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹取雙側(cè)腎臟用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 各組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平測(cè)定各組小鼠均于造模后第8日經(jīng)眶內(nèi)靜脈采血1 mL，靜置15 min 后，1 500 r·min-1離心 10 min 取上清液，按照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀通過(guò)比色法測(cè)定血清BUN、CRE、SOD、MDA和GSH水平。

1.5 各組小鼠腎組織形態(tài)學(xué)觀察眶內(nèi)靜脈采血后處死小鼠，剖腹取左側(cè)腎臟，生理鹽水沖洗，40 g·L-1多聚甲醛溶液固定48 h，采用梯度乙醇脫水，二甲苯固定，石蠟包埋切片(層厚5～8 μm)，進(jìn)行常規(guī)HE染色和PAS染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察小鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.6 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH 水平測(cè)定各組小鼠分別取右側(cè)腎組織0.2 g，加入1 mL RIPA裂解液，在冰盒上用玻璃勻漿器研磨，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液提取總蛋白。按照試劑盒的步驟使用酶標(biāo)儀在550 nm處通過(guò)比色法測(cè)定腎組織勻漿中SOD、MDA、GSH 水平。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠腎組織中單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平取0.15 mL腎組織蛋白加入到酶標(biāo)板中，先加等體積的雙蒸水稀釋?zhuān)倜靠准尤?0.3 mL 酶標(biāo)抗體工作液，37 ℃暗處孵育60 min,蒸餾水洗滌3次，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值，通過(guò)比色法計(jì)算各組小鼠腎組織中 MCP-1、TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎組織病理學(xué)表現(xiàn)結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。HE染色顯示，空白組小鼠腎小管管壁呈充盈狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核藍(lán)色深染(圖1A)；模型組小鼠腎小管上皮細(xì)胞大部分受損壞死，細(xì)胞質(zhì)大量減少，部分細(xì)胞的細(xì)胞核變大，間質(zhì)充滿炎性細(xì)胞(圖1B)；環(huán)黃芪醇低劑量組小鼠部分腎小管上皮細(xì)胞溶解消失，間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管集中區(qū)域有網(wǎng)狀改變，與模型組小鼠比較腎組織病理情況有所改善(圖1C)；環(huán)黃芪醇中、高劑量組小鼠腎小管上皮細(xì)胞基本完整，管壁變薄，細(xì)胞質(zhì)減少，與模型組小鼠比較腎組織病理情況明顯改善(圖1D、圖1E)。PAS染色顯示，空白組小鼠基底膜結(jié)構(gòu)完整，著色較淺(圖2A)；模型組小鼠腎組織腎小球內(nèi)系膜紅色深染，基底膜增厚，提示腎小球內(nèi)糖原大量沉積，損傷嚴(yán)重(圖2B)；環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠基底膜與空白組比較均有所增厚，但與模型組比較有改善，腎小球的糖原沉積也明顯減少，腎組織的病理情況顯著好轉(zhuǎn)(圖2C、圖2D、圖2E)。

A:空白組；B：模型組；C：環(huán)黃芪醇低劑量組；D：環(huán)黃芪醇中劑量組；E：環(huán)黃芪醇高劑量組。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化(HE染色,×200)

Fig.1 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(HE staining,×200)

A:空白組；B：模型組；C：環(huán)黃芪醇低劑量組；D：環(huán)黃芪醇中劑量組；E：環(huán)黃芪醇高劑量組。

圖2 各組小鼠腎組織病理變化(PAS染色,×200)

Fig.2 Pathological changes of kidney tissues of mice in each group(PAS staining,×200)

2.2 各組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比較結(jié)果見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清BUN、CRE、MDA 水平顯著升高，SOD 和 GSH 水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與環(huán)黃芪醇低劑量組比較，環(huán)黃芪醇中、高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與環(huán)黃芪醇中劑量組比較，環(huán)黃芪醇高劑量組小鼠血清 BUN、CRE、MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

表1 5組小鼠血清BUN、CRE、SOD、MDA、GSH水平比較

組別nBUN/(mmol·L-1)CRE/(μmol·L-1)SOD/(ng·L-1)MDA/(μmol·L-1)GSH/(mg·L-1)空白組67.58±0.82 42.30±3.72 122.68±10.52 4.92±0.32 254.36±15.63 模型組624.46±3.02a77.67±6.67a78.58±6.78a6.52±0.54a176.48±26.34a環(huán)黃芪醇低劑量組622.17±1.67ab75.75±3.26ab85.86±12.03ab6.13±0.13ab192.33±18.36ab環(huán)黃芪醇中劑量組616.47±2.38abc71.28±3.12abc91.25±14.32abc5.87±0.06abc208.13±19.54abc環(huán)黃芪醇高劑量組68.64±1.75abcd51.59±4.07abcd106.16±8.97abcd5.33±0.11abcd221.56±14.65abcd

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與環(huán)黃芪醇低劑量組比較cP<0.05；與環(huán)黃芪醇中劑量組比較dP<0.05。

2.3 各組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH、MCP-1及TNF-α水平比較結(jié)果見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著升高，SOD、GSH水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。與模型組比較，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與環(huán)黃芪醇低劑量組比較，環(huán)黃芪醇中、高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與環(huán)黃芪醇中劑量組比較，環(huán)黃芪醇高劑量組小鼠腎組織MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

與空白組比較，模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與環(huán)黃芪醇低劑量組比較，環(huán)黃芪醇中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與環(huán)黃芪醇中劑量組比較，環(huán)黃芪醇高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 5組小鼠腎組織中SOD、MDA、GSH、MCP-1和TNF-α水平比較

組別nSOD/(U·mg-1 pro)MDA/(mmol·g-1 pro)GSH/(mg·L-1)MCP-1/(μmol·g-1)TNF-α/(μmol·g-1)空白組6152.72±15.68 7.31±0.42 376.58±48.35 6.72±1.98 2.18±1.02 模型組691.68±19.87a12.65±0.84a216.36±43.67a24.62±3.69a6.89±1.35a低劑量組695.86±15.14ab11.13±0.58ab236.23±51.26ab19.78±2.53ab5.14±0.97ab中劑量組6130.52±12.42abc10.86±1.12abc281.13±49.57abc14.02±1.97abc4.51±0.84abc高劑量組6142.56±13.77abcd9.03±0.84abcd315.36±39.42abcd9.18±2.03abcd3.24±1.14abcd

注：與空白組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05；與環(huán)黃芪醇低劑量組比較cP<0.05；與環(huán)黃芪醇中劑量組比較dP<0.05。

3 討論

急性腎損傷是一種由多種復(fù)雜原因?qū)е碌呐R床綜合征，目前，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能有以下幾種：(1)通過(guò)炎性因子途徑介導(dǎo)急性腎小球腎炎；(2)通過(guò)腎小管毒性致急性腎小管壞死；(3)影響腎臟的血流動(dòng)力學(xué)，使腎臟血流灌注減少，造成腎損傷[8-10]。急性腎損傷的病因包括藥物因素、手術(shù)因素、慢性疾病等。藥物因素是導(dǎo)致急性腎損傷的首位病因，其中以氨基糖苷類(lèi)藥物最常見(jiàn)[11-12]。慶大霉素是一種療效確切的氨基糖苷類(lèi)抗生素，能夠作用于細(xì)菌體內(nèi)的核糖體，從而抑制細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成，并可破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性，主要用于治療革蘭陰性菌引起的感染，但其腎毒性一直受到關(guān)注。慶大霉素的水溶性較高，但血漿蛋白結(jié)合率較低，在體內(nèi)幾乎無(wú)法進(jìn)行代謝轉(zhuǎn)化，只能以原形從腎臟排泄，當(dāng)慶大霉素進(jìn)入腎臟近曲小管上皮細(xì)胞時(shí)容易蓄積，從而損傷細(xì)胞內(nèi)的多種細(xì)胞器，使細(xì)胞變性壞死，腎臟功能紊亂；同時(shí)，慶大霉素還可以抑制線粒體的功能，產(chǎn)生氧代謝產(chǎn)物，引起腎組織損傷。

黃芪為傳統(tǒng)中草藥，具有補(bǔ)中益氣、健脾利水的作用，臨床用于治療糖尿病腎病、慢性腎炎蛋白尿。有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪能減少尿蛋白，改善腎功能，并可以減輕小管間質(zhì)纖維化[13]。環(huán)黃芪醇是從黃芪中提取的中藥單體,具有較好的藥理活性，研究表明，環(huán)黃芪醇可以改善急性腎損傷[7]。近年來(lái)，藥物引起的急、慢性腎衰竭日益增多，探尋預(yù)防和治療急性腎損傷的藥物具有重要意義。因此，本研究通過(guò)制備慶大霉素誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型，并給予環(huán)黃芪醇干預(yù)，以探討環(huán)黃芪醇對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)小鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

本研究中，小鼠腎組織病理組織學(xué)觀察顯示，空白組小鼠基底膜結(jié)構(gòu)完整，腎小管管壁充盈，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；模型組小鼠基底膜增厚，腎小球內(nèi)糖原大量沉積，損傷嚴(yán)重，腎小管上皮細(xì)胞大部分受損壞死，間質(zhì)充滿炎性細(xì)胞，且模型組小鼠血清BUN、CRE水平顯著高于空白組，說(shuō)明慶大霉素導(dǎo)致小鼠發(fā)生急性腎損傷。環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠基底膜與空白組比較均有所增厚，但與模型組比較有改善，腎小管上皮細(xì)胞損傷明顯減輕，腎小球的糖原沉積也明顯減少，腎組織的病理情況明顯改善，且血清BUN、CRE水平較模型組顯著降低，說(shuō)明環(huán)黃芪醇能夠改善慶大霉素導(dǎo)致的小鼠急性腎損傷。

氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)在機(jī)體內(nèi)處于平衡狀態(tài)，維持體內(nèi)的新陳代謝。當(dāng)體內(nèi)氧化和抗氧化功能失衡時(shí)，會(huì)發(fā)生中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，大量氧化中間產(chǎn)物生成，從而導(dǎo)致組織損傷。有研究表明，慶大霉素導(dǎo)致的急性腎損傷與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)[14]。SOD和GSH是人體內(nèi)重要的酶抗氧化系統(tǒng)的主要成員，MDA則是機(jī)體內(nèi)重要的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物。本研究通過(guò)檢測(cè)比較慶大霉素誘導(dǎo)急性腎損傷小鼠血清和腎組織中MDA、SOD和GSH水平，觀察小鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞氧化損傷情況，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平顯著升高，SOD和GSH水平顯著降低，說(shuō)明慶大霉素導(dǎo)致了小鼠腎組織氧化應(yīng)激損傷；與模型組比較，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，且隨著環(huán)黃芪醇劑量的增加，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠血清及腎組織中MDA水平逐漸降低，SOD、GSH水平逐漸升高，提示環(huán)黃芪醇可以有效降低小鼠氧自由基生成，緩解氧化應(yīng)激情況，改善腎組織細(xì)胞氧化性損傷程度，通過(guò)改善小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)而對(duì)急性腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

炎癥反應(yīng)在急性腎損傷發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，損傷的腎小管上皮細(xì)胞會(huì)通過(guò)釋放MCP-1、TNF-α等炎性因子參與炎癥細(xì)胞的趨化與活化過(guò)程，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重[8]。與空白組比較，模型組及環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中炎性因子MCP-1、TNF-α水平顯著升高；與模型組比較，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低；且隨著環(huán)黃芪醇劑量的增加，環(huán)黃芪醇低、中、高劑量組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α水平顯著降低；說(shuō)明環(huán)黃芪醇可以有效降低急性腎損傷小鼠腎組織中的炎性因子水平，從而對(duì)急性腎損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，環(huán)黃芪醇可以顯著降低急性腎損傷小鼠血清CRE、BUN水平，并有效改善病理癥狀；另一方面，可以使急性腎損傷小鼠血清和組織中MDA水平顯著降低，SOD、GSH水平顯著升高，改善腎組織氧化性損傷程度；并顯著降低小鼠腎組織中 MCP-1、TNF-α水平，改善腎臟炎癥反應(yīng)。但急性腎損傷病因尚不明確，環(huán)黃芪醇是否還通過(guò)其他途徑干預(yù)這一過(guò)程，尚需要進(jìn)一步研究。