胸段硬膜外阻滯對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

胡淋淋，馬聞苛，李曉芳，張紅偉，樊 騰，楊明月，徐璐丹，張文杰，岳修勤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科,河南 衛(wèi)輝 453100)

急性心肌梗死是一種由于冠狀動(dòng)脈急性閉塞或狹窄導(dǎo)致的急性心血管疾病，患者多表現(xiàn)為長時(shí)間的壓榨樣胸骨后疼痛伴窒息感，休息或口服硝酸酯類藥物不能有效緩解，伴有血清心肌酶水平增高及動(dòng)態(tài)性心電圖變化，可并發(fā)惡性心律失常、心源性休克及心力衰竭，治療不及時(shí)常導(dǎo)致患者猝死[1]。急性心肌缺血后如何更好地保護(hù)缺血心肌，降低圍術(shù)期病死率，是目前臨床研究熱點(diǎn)。胸段硬膜外阻滯是臨床上常用的椎管內(nèi)麻醉方法之一，通過胸段硬膜外阻滯可以阻斷心臟交感神經(jīng)，減少交感神經(jīng)末梢兒茶酚胺類的釋放，使有病變的冠狀動(dòng)脈血管管徑擴(kuò)張，增加缺血心肌血液供應(yīng)，進(jìn)一步減少心肌缺血梗死引起的心肌細(xì)胞凋亡[2]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠心肌組織中凋亡蛋白Caspase-3活性，觀察胸段硬膜外阻滯對急性心肌梗死時(shí)心肌細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取8～10周齡清潔級(jí)健康雄性Wistar 大鼠50只(購于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(300±20)g，大鼠之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；排除急性心肌梗死后或硬膜外給藥后死亡大鼠14例，實(shí)際納入36例。

1.2 主要試劑與儀器大鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京森貝加公司，β-actin抗大鼠單克隆一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Jackson Immuno Research公司，放射免疫沉淀測定(radio-Immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、苯甲基磺酰氯(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)、聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液2×、上樣緩沖液(6×Loading Buffer)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine,TEMED)購自武漢博士德生物工程有限公司，焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)購自北京索萊寶科技有限公司，麗春紅染液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，脫脂奶粉購自美國Amresco公司，胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)購自韓國Biosharp公司；尼康普通雙目顯微鏡購自上海普赫光電科技有限公司，RGZ-120型體重計(jì)購自河南曙光健士醫(yī)療器械集團(tuán)股份有限公司，多功能生物信息采集系統(tǒng)、小動(dòng)物呼吸機(jī)購自上海奧爾科特生物科技公司，Mini ProTEBn 3 Cell小型垂直電泳儀、半干式轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自武漢博士德生物工程有限公司，96孔板購自美國Corning Costar公司，掃描儀購自愛普生有限公司，普通高速離心機(jī)、-80 ℃超低溫冰箱、全波長掃描酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和各組干預(yù)措施將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和羅哌卡因組，每組12只。造模前各組大鼠硬膜外腔置管，羅哌卡因組大鼠經(jīng)硬膜外腔注入5 g·L-1羅哌卡因(0.125 mL·kg-1)進(jìn)行胸段硬膜外阻滯[3]，假手術(shù)組和模型組大鼠硬膜外腔注入等量生理鹽水。羅哌卡因組大鼠給藥5～6 min 后若出現(xiàn)心率減慢，平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure，MAP)下降，大鼠眼瞼下垂，胸前阻滯區(qū)域體表溫度升高，胸腹部肌肉松弛，即判定為胸段硬膜外阻滯成功。

胸段硬膜外阻滯成功后，羅哌卡因組、模型組大鼠采用結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支的方法[4-6]制備急性心肌梗死模型，假手術(shù)組大鼠僅穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。結(jié)扎后大鼠左心室前壁顏色變蒼白、心電圖出現(xiàn)ST-T融合抬高，提示造模成功。

1.4 各組大鼠心電圖及血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測在大鼠四肢安裝心電圖導(dǎo)聯(lián)，連接多功能生物信號(hào)采集系統(tǒng)，記錄開胸前(T0)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前(T1)、冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后3 h(T2)各組大鼠心率(heart rate，HR)、心電圖走勢及MAP。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測各組大鼠血清cTnI水平分別于T0、T1、T2時(shí)取大鼠動(dòng)脈血0.5 mL，室溫靜置20 min，1 000×g離心20 min，取血清,應(yīng)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法測定cTnI水平。

1.6 Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)取梗死區(qū)心肌組織，液氮冷凍后-80 ℃保存待測。取100 mg冷凍心肌組織，剪碎后按照1 mg組織加入20 μL裂解液的配比，使用組織研磨器將組織粉碎，冰上裂解40 min，4 ℃下12 000×g離心20 min，取上清液。采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度，加入5×loading buffer把樣品調(diào)成相同濃度，沸水中煮5 min變性。蛋白變性后將其加樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，含50 g·L-1脫脂奶粉的洗滌緩沖液室溫封閉2 h。TBST洗膜2次，每次 10 min，然后加入稀釋后的一抗，4 ℃溫育過夜，洗滌緩沖液搖洗3次，每次10 min，加入稀釋后的二抗，孵育2 h。使用拍照成像系統(tǒng)顯像拍照，用Image-Pro Plμs6.0圖像分析軟件測定蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠HR和MAP比較結(jié)果見表1。假手術(shù)組大鼠T0、T1、T2時(shí)HR、MAP兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP在T2時(shí)顯著低于T0、T1時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP在T0、T1時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組大鼠T0、T1時(shí)HR、MAP比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T2時(shí)，模型組和羅哌卡因組大鼠HR、MAP顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；羅哌卡因組大鼠HR、MAP顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組大鼠HR和MAP比較

組別nHR/(次·min-1)MAP/mmHg假手術(shù)組12 T0434.72±4.95106.76±10.57 T1431.64±5.15105.78±11.88 T2438.76±4.8799.85±7.96模型組12 T0432.68±5.05104.58±8.68 T1433.56±5.04106.56±8.55 T2372.11±4.74ab74.36±5.04ac羅哌卡因組12 T0435.87±4.45105.35±11.89 T1430.63±4.85104.47±12.78 T2399.85±5.15abc90.87±6.56abc

注：與同組T0、T1時(shí)比較aP<0.05；與假手術(shù)組比較bP<0.05；與模型組比較cP<0.05；1 mmHg=0.133 kPa。

2.2 3組大鼠血清cTnI水平比較結(jié)果見表2。假手術(shù)組大鼠血清cTnI水平在T0、T1、T2時(shí)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平在T2時(shí)顯著高于T0、T1時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平在T0和T1時(shí)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T0、T1時(shí)，3組大鼠血清cTnI水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；T2時(shí)，模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；T2時(shí)，羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠血清cTnI水平比較

組別ncTnI /(μg·L-1)T0T1T2假手術(shù)組1214.85±1.5715.31±2.1415.56±1.76模型組1214.46±1.2814.45±3.2625.76±1.42ab羅哌卡因組1214.67±1.2914.63±3.2420.15±1.39abc

注：與同組T0、T1時(shí)比較aP<0.05；與假手術(shù)組比較bP<0.05；與模型組比較cP<0.05。

2.3 3組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較假手術(shù)組、模型組和羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白相對表達(dá)量分別為0.62±0.02、0.95±0.06、0.85±0.04，羅哌卡因組、模型組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

cTnI僅存在于心房和心室，與骨骼肌無交叉反應(yīng)，特異性很強(qiáng)[7]。心肌細(xì)胞膜完整時(shí)cTnI不能滲出，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血、缺氧，細(xì)胞膜的完整性受到破壞時(shí)，cTnI通過受損的細(xì)胞膜滲出進(jìn)入血管，其在血清中水平可達(dá)正常值的20～50倍，明顯高于其他酶類，在血清中持續(xù)時(shí)間較肌酸激酶同工酶雜化型更長。cTnI在AMI發(fā)生后2～4 h即升高，14～20 h 時(shí)達(dá)到高峰值，5～7 d恢復(fù)正常，敏感性非常高[8]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支3 h后，模型組和羅哌卡因組大鼠血清cTnI水平較假手術(shù)組明顯升高，而羅哌卡因組大鼠給予羅哌卡因胸段硬膜外干預(yù)后，血清cTnI水平較模型組明顯降低，說明結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支后，大鼠心肌確實(shí)存在缺血性損傷，而胸段硬膜外干預(yù)對缺血心肌有一定的保護(hù)作用。

有研究表明，胸段硬膜外麻醉可降低HR、全身血管阻力和心肌梗死面積，保護(hù)心功能，增加心內(nèi)膜和心外膜血流[9]。本研究結(jié)果顯示，硬膜外麻醉后大鼠MAP有輕微下降，HR無明顯變化。胸段硬膜外阻滯阻斷起源于胸上段的心臟傳入神經(jīng)和交感傳出神經(jīng)，阻止心臟應(yīng)激神經(jīng)反射和抑制去甲腎上腺素誘發(fā)的急性心肌缺血，有助于減少心肌細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡是心肌持續(xù)性缺血導(dǎo)致心肌損傷的一種主要形式。細(xì)胞凋亡和壞死可能導(dǎo)致心肌梗死面積擴(kuò)大。有研究報(bào)道，在心外膜主要?jiǎng)用}閉塞后，細(xì)胞凋亡可能是早期心肌損傷的主要形式，而壞死可能成為心肌梗死的主要原因[10]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎3 h后，羅哌卡因組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白的相對表達(dá)量較模型組明顯下降，說明硬膜外干預(yù)對結(jié)扎冠狀動(dòng)脈誘發(fā)的心肌缺血性損傷有一定的保護(hù)作用。胸段神經(jīng)阻滯可導(dǎo)致心臟的后負(fù)荷循環(huán)和外周阻力減少，這可能有助于改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)和心臟功能。然而，在冠狀動(dòng)脈永久閉塞后，循環(huán)和冠狀動(dòng)脈灌注壓的改變以及局部麻醉藥的直接作用對缺血心肌的影響較小，而心肌代謝可能在其中發(fā)揮更大的作用。心肌細(xì)胞缺血后發(fā)生凋亡的機(jī)制可能與代謝、神經(jīng)、內(nèi)分泌有關(guān)。冠狀動(dòng)脈循環(huán)障礙后心肌的無氧代謝可引發(fā)連鎖反應(yīng)，可能導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)活性上調(diào)和兒茶酚胺在心肌中的大量釋放。心肌缺血后，血液供應(yīng)中斷，在細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷三磷酸分解產(chǎn)生腺苷；厭氧代謝使氫離子聚積，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載[11]，其他離子運(yùn)輸機(jī)制也受到影響，代謝性化學(xué)物質(zhì)導(dǎo)致心臟神經(jīng)末梢和皮層受到刺激而產(chǎn)生傳入神經(jīng)沖動(dòng)增加的變化，反射性地引起交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，兒茶酚胺釋放增加。研究表明，在急性心肌缺血早期心肌組織中兒茶酚胺濃度過高會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[12-13]。過度釋放的去甲腎上腺素，通過激活心肌細(xì)胞β-腎上腺素能受體，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)化腺核苷一磷酸水平，磷酸化的L-型鈣通道和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，增強(qiáng)心肌細(xì)胞凋亡[14]。

硬膜外阻滯不僅在缺血性心臟病治療中應(yīng)用廣泛，在心臟手術(shù)、胸科手術(shù)等重大手術(shù)應(yīng)激誘發(fā)的心肌損傷保護(hù)方面也有獨(dú)特的優(yōu)勢。對冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn)，硬膜外阻滯可擴(kuò)張粥樣硬化的冠狀動(dòng)脈血管，提高冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)后患者左心室的收縮功能[15]，降低血清中cTnI水平，降低術(shù)后心肌缺血的發(fā)生率，胸段硬膜外麻醉還可激活缺血心肌組織內(nèi)抗凋亡機(jī)制，上調(diào)心肌組織內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2的含量和抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子[16],減少心肌細(xì)胞凋亡。在大鼠和兔缺血再灌注動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)中證明，Caspase家族的三肽抑制劑能夠減少心肌梗死面積[17]。改善心肌血供，維持循環(huán)穩(wěn)定，保證足夠數(shù)量的心肌收縮細(xì)胞是缺血性心血管疾病治療的最終目標(biāo)。胸段硬膜外阻滯通過直接擴(kuò)張狹窄的冠狀動(dòng)脈來降低血管阻力，減少心肌氧耗。在氧供一定的前提下，降低心肌氧耗是保護(hù)心肌的主要措施。

綜上所述，胸段硬膜外阻滯能夠減輕AMI后的心肌細(xì)胞凋亡，對缺血或梗死心肌有一定的保護(hù)作用;其機(jī)制可能與抑制心交感神經(jīng)過度興奮，減少兒茶酚胺類釋放，緩解冠狀動(dòng)脈痙攣，增加心肌氧供有關(guān)。