賴氨酰氧化酶樣蛋白2在膽管癌中的表達以及與血管內(nèi)皮生長因子A及血管生成的關(guān)系

彭滔，李大江，王曙光

（1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科研究所，重慶 400038；2.長江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，湖北 荊州 434000）

膽管癌（cholangiocarcinoma,CCA）是起源于肝內(nèi)外膽樹上皮且具有高度侵襲性的惡性腫瘤，盡管發(fā)生率不高，但是病死率高[1-2]。盡管在手術(shù)方面取得了很大進步，但是5年生存率仍然較低[3]。因此尋找新的靶點為治療膽管癌提供新的策略。賴氨酰氧化酶樣蛋白2（lysyl oxidase-like 2，LOXL2）是細胞外基質(zhì)修飾酶的賴氨酰氧化酶家族成員之一。LOXL2最初是從人成纖維細胞分離出來，并參與細胞外基質(zhì)的重塑。各項研究表明LOXL2高表達促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及與患者的預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。課題組先前通過免疫組化證實了LOXL2在膽管癌組織中高表達，并促進了膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移[4]，但是其下游機制不是很清楚，為了探索LOXL2在膽管癌中的作用機制，本研究進一步通過GEO數(shù)據(jù)庫證實LOXL2在膽管癌中表達情況，利用GSEA分析LOXL2與血管形成的關(guān)系，在GEO數(shù)據(jù)中分析LOXL2與血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）表達的關(guān)系，并在體外實驗通過干預(yù)LOXL2觀察VEGA的表達變化及其分泌水平對血管形成影響。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

1.1.1 數(shù)據(jù)來源 膽管癌數(shù)據(jù)從公共數(shù)據(jù)庫GEO下載（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，GSE76297，GSE107943，GSE26566，GSE89749）。

1.1.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） GSEA用來評估一個預(yù)先定義的基因集的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢，從而判斷其對表型的貢獻[7]。根據(jù)GSE76297數(shù)據(jù)庫中癌組織LOXL2 mRNA的表達中位數(shù)劃分為高低兩組，選取MsiDB（Molecular Signatures Database v6.2）中與血管生成相關(guān)的基 因 集（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）。GSEA分析使用GSEA2.0.9（http://www.broadinstitute.org/gsea）。根 據(jù) 劃分的LOXL2 mRNA高低兩組通過GSEA軟件鑒別LOXL2與血管生成之間的關(guān)系。

1.2 細胞實驗

1.2.1 細胞培養(yǎng)及病毒轉(zhuǎn)染 QBC939和RBE膽管癌細胞系由本實驗室儲存，人臍靜脈內(nèi)皮細 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自美國ATCC細胞庫，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清（ZETA，日本）的RPMI 1640，細胞培養(yǎng)在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。靶向LOXL2的干擾病毒和過表達病毒購自吉瑪公司（上海）。細胞鋪6孔板過夜后，加入107（100 μL）病毒懸液過夜后擴增轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)流式篩選（mCherry 熒光）。

1.2.2 Western blot檢測 使用加有蛋白酶抑制劑（羅氏，美國）RIPA裂解液（Sigma-Aldrich，美國）提取細胞總蛋白，細胞刮收集貼壁細胞，冰上裂解15 min，14 000 r/min，4 ℃離心15 min，棄沉淀，收集上清。BCA法測定濃度，100 ℃變性 10 min。經(jīng)SDS-PAGE轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入GAPHD一抗（1:10 000，三 鷹）、LOXL2（1:2 000，Abcam）、VEGFA （1:2 000，Abcam）4 ℃封閉過夜，PBST漂洗10 min× 3次，加入二抗（1:4 000，Abcam）室溫孵育2 h，PBST漂洗10 min×3次。ECL發(fā)光顯影成像。

1.2.3 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測 總RNA提取根據(jù)Eastep Super試劑盒方案進行（Promega，USA）。在CFX96實時定量儀器（Bio-Rad，美國）中使用SYBR試劑（Takara，日本）進行實時定量PCR。實驗重復(fù)3次。LOXL2正 向 引 物：5'-TCC TCA ATG CGG AGA TGG TG-3'，反 向 引 物：5'-CTG TGA CAG TCG TGC CAG AT-3'；VEGFA正 向 引 物：5'-GGG CAG AAT CAT CAC GAA GT-3'，反向引物：5'-TGG TGA TGT TGG ACT CCT CA-3'；GAPDH正向引物：5'-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3'，反向引物：5'-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3'。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 將膽管癌細胞接種于6孔板中，過夜后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集條件培養(yǎng)基，根據(jù)VEGFA ELISA試劑盒（Abebio，美國）方案進行。

1.2.5 血管形成檢測 將基質(zhì)膠加入到24孔板中，含有1x105個HUVECs的條件培養(yǎng)基500 μL加入到每孔中，培養(yǎng)箱中孵育8 h。倒置顯微鏡觀察形成的血管數(shù)并拍照（100倍），每個樣品隨機選取3個不同的視野拍照，用ImageJ軟件計算形成的血管數(shù)，并比較各組之間的差異。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果均采用IBM SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)性變量采用雙尾t檢驗。LOXL2和VEGFA之間的相關(guān)性分析采用線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LOXL2在人膽管癌組織中的表達

通過下載GEO數(shù)據(jù)，進行分析膽管癌和癌旁LOXL2的表達關(guān)系，在GSE76297和GSE107943數(shù)據(jù)庫中分析發(fā)現(xiàn)，LOXL2在膽管癌組織中明顯高于癌旁組織（均P＜0.0001）。并且在成對的癌和癌旁樣本中，癌組織中的LOXL2也明顯高于癌旁組織（均P＜0.0001）（圖1）。

2.2 GSEA分析

下載GSE76297數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，通過GSEA分析LOXL2參與血管形成相關(guān)的基因集，發(fā)現(xiàn)LOXL2參與兩個血管形成的基因集（NES=1.583，名義P=0.012；NES=1.632，名義P=0.002）（圖2）。

2.3 LOXL2的表達與VEGFA表達相關(guān)性分析

通過GSE26566、GSE76297、GSE89749和GSE107943數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，LOXL2的表達與VEGFA的表達正相關(guān)（r=0.320、0.243、0.234、0.665，均P＜0.05）（圖3）。

圖1 LOXL2在膽管癌和癌旁組織中的表達 Figure1 Expressions of LOXL2 in CCA and tumor adjacent tissues

圖2 GSE76297數(shù)據(jù)的GSEA分析Figure2 GSEA analysis using GSE76297 data

圖3 在GEO數(shù)據(jù)中LOXL2和VEGFA的表達關(guān)系Figure3 Correlation between LOXL2 and VEGFA in GEO datasets

2.4 干預(yù)LOXL2后VEGFA的表達的變化

分析GEO數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)LOXL2與VEGFA的正相關(guān)，故推測LOXL2可能調(diào)控VEGFA的表達，筆者前期的研究表明LOXL2蛋白在QBC939比RBE細胞要高[7]。因此選擇了在QBC939細胞轉(zhuǎn)染干擾LOXL2病毒，RBE細胞轉(zhuǎn)染過表達LOXL2病毒，為了提高轉(zhuǎn)染效率，過表達和干擾的細胞經(jīng)過流式篩選，熒光顯微鏡觀察過表達和干擾的細胞熒光（圖4）。通過Western blot和RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在QBC939細胞干擾LOXL2后，VEGFA的蛋白和mRNA表達明顯下調(diào)（均P＜0.01），在RBE細胞過表達LOXL2后，VEGFA的蛋白和mRNA表達明顯上調(diào)（均P＜0.01）（圖5）。

2.5 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的分泌水平

進一步通過ELISA實驗檢測干預(yù)LOXL2后對VEGFA的分泌影響，發(fā)現(xiàn)在QBC939細胞干擾LOXL2后，與對照組比較，VEGFA的分泌水平明顯減少（P＜0.01），而在RBE細胞過表達LOXL2后，與對照組比較，VEGFA的分泌水平明顯增加（P＜0.01）（圖6）。

圖4 熒光顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染的RBE細胞和QBC939（×400）Figure4 RBE and QBC939 cells transfected with the lentivirus observed under fluorescence microscopy (×400)

圖5 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的表達情況mRNA表達Figure5 VEGFA expressions in CCA cells after LOXL2 interventions

圖6 干預(yù)LOXL2后膽管癌細胞VEGFA的分泌水平 Figure6 Secretion levels of VEGFA in CCA cells after LOXL2 interwentions

2.6 干預(yù)LOXL2后對血管形成的影響

收集膽管癌細胞各處理的條件培養(yǎng)基組進行血管形成實驗，結(jié)果顯示，過表達LOXL2的RBE細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs與對照組比較，管腔形成數(shù)明顯增加（P＜0.01），而干擾LOXL2的QBC939細胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs與對照組比較，管腔形成數(shù)明顯減少（P＜0.01）（圖7）。

圖7 血管形成實驗結(jié)果 Figure7 Results of the angiogenesis assay

3 討 論

血管生成在人類生殖、器官形成、傷口愈合以及組織修復(fù)過程中發(fā)揮著重要作用，同樣在各種疾病如腫瘤進展中也起著關(guān)鍵角色[8]。目前血管生成已經(jīng)成為惡性腫瘤公認的標志之一，腫瘤的血管通過提供營養(yǎng)和氧來維持腫瘤的侵襲性生長和轉(zhuǎn)移[9]。多種生長因子通過不同的機制激活血管生成，其中VEGFA是最主要的生長因子，激活信號通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進內(nèi)皮細胞出芽以及管腔形成[10-11]。盡管目前抗血管生成藥物已用于臨床，但是在治療膽管癌方面作用有限以及臨床副作用多[12]，因此有必要深入理解膽管癌血管生成的分子機制。本研究通過數(shù)據(jù)庫分析及細胞水平驗證，LOXL2通過上調(diào)VEGFA促進膽管癌血管生成，從而促進膽管癌的進展。

LOXL2是賴氨酰氧化酶家族5個成員（LOX、LOXL1、LOXL2、LOXL3、LOXL4）中的一員。賴氨酰氧化酶家族蛋白失調(diào)與纖維結(jié)締組織疾病、心血管疾病以及腫瘤密切相關(guān)[13]。LOXL2在各種腫瘤中高表達，參與了腫瘤的進展過程，包括乳腺癌、肺癌[5,14]。筆者先前的研究[7]通過免疫組化發(fā)現(xiàn)LOXL2蛋白水平在膽管癌組織高表達，參與了膽管癌的進展，減少了患者的總體生存率以及無病進展期生存率。在GEO數(shù)據(jù)庫分析，進一步證實了LOXL2的mRNA水平在膽管癌組織高表達。LOXL2通過不同的作用機制促進了腫瘤的進展。LOXL2可被腫瘤細胞分泌到細胞外，發(fā)揮的主要功能是催化細胞外基質(zhì)膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)及硬化[15]，細胞外基質(zhì)的改變不僅為腫瘤細胞的生存和遷移提供了良好的微環(huán)境，還可以通過整合素等信號通路促進了腫瘤細胞的遷移和轉(zhuǎn)移[16]。細胞內(nèi)的LOXL2發(fā)揮的作用表現(xiàn)在兩方面，一方面在核內(nèi)與一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而促進腫瘤的進展[17-18]，另一方面還參與了一些信號通路的激活[19]。

Zaffryar-Eilot等[20]使用LOXL2單克隆抗體（AB0023）抑制了卵巢癌、肺癌以及乳腺癌的血管形成。同時Wang等[21]發(fā)現(xiàn)在肝細胞肝癌HIF-1α誘導(dǎo)血管形成是經(jīng)過LOXL2介導(dǎo)形成。但是LOXL2誘導(dǎo)血管形成的機制還不是很清楚，本研究通過GSEA分析發(fā)現(xiàn) LOXL2也可能參與了膽管癌的血管形成。由于VEGFA在血管形成中起主要作用，本研究隨后在GEO數(shù)據(jù)庫分析LOXL2與VEGFA的表達關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者的表達在多個樣本庫中密切相關(guān)，在體外實驗，通過干預(yù)LOXL2觀察對VEGFA的表達影響，證實LOXL2能夠調(diào)節(jié)VEGFA的表達和分泌，并且影響血管形成。最新研究表面，LOXL2在肝、肺、腎[22]以及心臟纖維化的過程中起主要作用，并且LOXL2單克隆抗體在動物實驗?zāi)軌蛞种聘卫w維化[23-25]。因此LOXL2可能成為膽管癌治療的一個新靶標。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2在膽管癌中高表達，通過上調(diào)VEGFA促進了腫瘤的血管形成，為LOXL2成為膽管癌治療的靶點提供理論依據(jù)。