蓬莪術(shù)乙醇提取物的抗IBV作用研究

向談婷，劉衛(wèi)榮，彭小琴，高中南，方守國

（長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，荊州 434025）

禽傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是一種正股單鏈的RNA病毒，屬于冠狀病毒科（coronaviridae）、冠狀病毒屬（coronavirus）[1]，能夠使雞患上傳染性支氣管炎，并且影響雞蛋的質(zhì)量，是危害養(yǎng)雞業(yè)的主要病毒病[2]。目前，對于IBV的主要防控手段是疫苗，但由于IBV的血清型眾多，使得疫苗免疫效果及安全性無法保證。蓬莪術(shù)主要產(chǎn)于四川省、福建省等，研究表明蓬莪術(shù)具有較好的抗腫瘤、抗血栓、抗炎癥、抗病毒等作用[4]。本研究以rIBV-3ab-Luc及rIBV做供試病毒，探究蓬莪術(shù)乙醇提取物對IBV的抑制作用及其對干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和STAT1（signal transducers and activators of transcription 1，STAT1）細(xì)胞因子的調(diào)控作用，為蓬莪術(shù)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Life Technology公司；胰酶購自Gibco公司；DMEM basic（1×）購自賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；Trizol、熒光素酶試劑盒購自Invitrogen公司；熒光定量試劑（RR047A）購自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞與病毒rIBV-3ab-Luc及rIBV，由方守國教授研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建；H1299細(xì)胞，由新加坡南洋理工大學(xué)生物學(xué)院病毒實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 中草藥乙醇提取物的制備將蓬莪術(shù)磨成粉并稱重，用80%乙醇浸泡7 d，浸提液過濾，提取物的初始濃度為0.566 5 g/mL，放入4℃冰箱備用。

1.4 測定最大無毒濃度參照參考文獻(xiàn)[5]，使用MTT（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法測定最大無毒濃度。

1.5 熒光素酶測定當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，吸去原培養(yǎng)液，PBS洗2次后，進(jìn)行下列處理：1）加0.9 mL含有10%FBS的培養(yǎng)液，再加入6 μL提取物混勻。培養(yǎng)24 h后，換無FBS的培養(yǎng)液，并加入100 μL 0.5 MOI病毒；2）加無FBS的培養(yǎng)液，將6 μL提取物與100 μL 0.5 MOI病毒混合20 min后，用其混合液處理細(xì)胞；3）加無FBS的培養(yǎng)液，再加100 μL 0.5 MOI病毒，2 h后加入提取物6 μL。吸去培養(yǎng)液，PBS洗2次，加入100 μL細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，15 185×g離心5 min；取20 μL離心上清液和50 μL底物移至新的1.5 mL離心管中，迅速放入熒光檢測儀中檢測。

1.6 實(shí)時熒光定量RT-PCR（real-time fluorescence quantitative RT-PCR，RT-qPCR）檢測IBV感染H1299細(xì)胞2 h后，提取物處理被感染的H1299細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)16～24 h，收獲細(xì)胞。按照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，超微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度，-20℃保存。RT-qPCR檢測步驟：（1）cDNA合成：按照熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，-20℃保存。（2）qPCR反應(yīng)：以cDNA為模板，94℃預(yù)變性30 s，94℃變性5 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共40個循環(huán)。所用引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 primer sequences

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測結(jié)果OD值越大，說明細(xì)胞活性越強(qiáng)，如果OD值大小與對照組OD值大小無差異（P＞0.05），不具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明該濃度對細(xì)胞生長無抑制作用。由圖1可知，當(dāng)稀釋倍數(shù)為0即提取物的初始濃度為0.566 5 g/mL時，其OD值明顯小于其他稀釋倍數(shù)和對照組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明此濃度的藥物對細(xì)胞生長有抑制。而當(dāng)稀釋倍數(shù)為1、2、3、4時，OD值大小與對照組比較，差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），因此確定提取物的最大無毒濃度為0.283 3 g/mL。

圖1 MTT法檢測最大無毒濃度Fig.1 The maximum toxic concentration determined by MTT assay

2.2 蓬莪術(shù)乙醇提取物抑制IBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)是對靶基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，熒光值越小說明病毒mRNA越少，從而間接地反映出提取物是否對病毒具有抑制作用。由圖2可知，3種處理方式中，病毒加藥組的熒光值均小于病毒對照組熒光值，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)提取物抑制IBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

2.3 RT-qPCR檢測干擾素能夠與受體結(jié)合，激活JAK/STAT信號通路。但是由圖3可知，各處理之間IFN-γ表達(dá)量無差異，推測可能是IFN-α/β或者其他的細(xì)胞因子在發(fā)揮作用，來激活JAK/STAT信號通路。STAT1是JAK/STAT信號通路中的一種因子，由圖3可知，病毒加藥組STAT1表達(dá)量顯著低于病毒對照組，具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），推測提取物可能通過JAK/STAT信號通路影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。IBV-N表達(dá)量的差異也具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），證實(shí)提取物抑制了IBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。

圖2 蓬莪術(shù)乙醇提取物不同處理方式對IBV的抑制效果Fig.2 Inhibition of IBV by different treatment methods of ethanol extract from Zedoary

圖3 RT-qPCR檢測細(xì)胞因子的表達(dá)Fig.3 Expression of cytokines detected by RT-qPCR

3 討論

蓬莪術(shù)是多年生的宿根草本，根莖含揮發(fā)油，油中主要成分為倍半萜烯類，具有抗腫瘤、抗早孕、抗凝血、抗炎癥、抗菌、抗氧化和保肝等活性[6]。錢伯文教授運(yùn)用莪術(shù)治療惡性腫瘤[7]，孫濤等[8]發(fā)現(xiàn)醋炙蓬莪術(shù)具有活血化瘀作用，王茜等[9]發(fā)現(xiàn)蓬莪術(shù)葉精油對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌均有抑制作用，夏泉等[10]發(fā)現(xiàn)莪術(shù)油有抗流感病毒的作用。目前對蓬莪術(shù)的研究多集中于對其成分的分離和鑒定及其在抗腫瘤、抗早孕、抗炎癥等方面的功能研究，而抗病毒作用及抗病毒作用機(jī)理的研究甚少。

本研究采用3種不同的加藥方式進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)3種處理方式中，病毒加藥組的熒光值均小于病毒對照組的熒光值，說明提取物抑制了IBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。IFN-γ又稱為免疫干擾素，是一種高效的抗病毒細(xì)胞因子[11]。IFN-γ能與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合激活JAK/STAT信號通路，引起機(jī)體的免疫反應(yīng)[12]。病毒感染細(xì)胞后，產(chǎn)生一些抗病毒細(xì)胞因子，例如干擾素，與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化，使得與受體偶聯(lián)的JAK激酶活化，進(jìn)而催化STAT1蛋白發(fā)生磷酸化修飾，磷酸化的STAT1蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)提取物對IFN-γ沒有顯著性影響，但是對STAT1具有顯著性影響，推測可能是IFN-α/β或者其他細(xì)胞因子在發(fā)揮作用，來激活JAK/STAT信號通路。關(guān)于提取物是否通過JAK/STAT信號通路影響病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，還需進(jìn)一步的深入研究。本研究結(jié)果為蓬莪術(shù)作為抗IBV中草藥的開發(fā)和利用提供理論支持。蓬莪術(shù)抗IBV的作用機(jī)制仍然需要進(jìn)一步研究。