單增李斯特菌srtA基因缺失株的構建及srtA基因對其毒力的影響研究

張奇文，凌 晨，吳學林，馬 勛，薄新文

（1.石河子大學動物科技學院，石河子 832003；2.天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830010；3.新疆農墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，石河子832003）

革蘭氏陽性菌的細胞壁是由多層肽聚糖構成，表面分子磷壁酸及表面蛋白等均呈現(xiàn)在肽聚糖上，表面蛋白的種類不同，錨定機制也有所不同[1]。表面蛋白錨定到肽聚糖的過程由分選酶催化完成，這類蛋白在致病菌中發(fā)揮重要的毒力作用[2]。1999年Mazmanian等[3]以SPA為模型研究了表面蛋白的錨定過程，表明分選酶A（sortase A，SrtA）與SPA錨定到細胞壁表面過程密切相關，并且證實SrtA通過識別LPXTG保守基序，將蛋白共價結合到細胞壁肽聚糖上。Pallen等[4]對已測序的92個細菌基因組進行分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)革蘭氏陽性菌中都存在分選酶同源基因，只是在不同細菌基因組中存在的數(shù)量、種類、功能等存在一定差異。

單核細胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是革蘭氏陽性、胞內寄生菌，一種重要的食源性人獸共患病原菌，可以穿越宿主的腸道屏障，血腦屏障和血胎屏障，臨床上引起腸胃炎、腦膜炎、腦炎、敗血癥、流產(chǎn)等癥狀，LM的致病過程涉及多種毒力因子及其相關的酶類。LM表面有多種前體分子中含有LPXTG基序的表面蛋白，對于LM致病性發(fā)揮重要作用，如InlA、InlJ、LapB和VIP等[5-10]。在LM中，srtA是由222個氨基酸組成的分選酶，參與一些含有LPXTG基序的表面蛋白與肽聚糖的結合過程[11]。目前已報道，srtA基因缺失以后，可以影響表面毒力蛋白錨定到細胞壁，從而影響細菌毒力[3,11-13]。

血腦屏障是LM引起腦膜炎、腦炎必須穿越的屏障[14]，目前對于LM跨越血腦屏障的研究主要通過建立感染小鼠腦炎模型觀察病變特征[15]，體外血腦屏障研究則主要是腦微血管碎段模型、腦微血管內皮細胞模型、腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共同培養(yǎng)模型[16]，而培養(yǎng)腦血管內皮細胞是目前國內外常用的血腦屏障模型。本研究以新疆發(fā)病綿羊腦內臨床分離株LM90SB2為研究對象[17]，利用同源重組的方法構建srtA基因缺失株（LM90SB2-ΔsrtA），與LM90SB2株比較在腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）的粘附、侵襲及胞內和小鼠腦內增殖的差異，探討srtA基因在LM90SB2穿越血腦屏障中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒、細胞 LM分離株LM90SB2是2000年石河子大學動物科技學院微生物免疫實驗室從新疆發(fā)病綿羊腦內分離得到的單核細胞增生性李斯特菌，由本實驗室鑒定后保存，血清型為4b型；自殺性質粒pKSV7由浙江大學動物科學學院分子微生物與食品安全實驗室饋贈；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞和pMD19-T（simple）購自大連寶生物（TaKaRa）公司。原代人腦微血管內皮細胞（human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）購買自美國ScienCell Research Laboratories；鼠腦微血管內皮細胞（murine brain microvasular endothelial cell，MBMEC）購自廣州吉妮歐生物科技有限公司；豬腸上皮細胞（swine intestinal epithelial cell，SIEC）和小鼠巨噬細胞RAW264.7由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、PfuDNA高保真聚合酶、dNTP、PCR Mix、DNA Marker DL2000均購自廣州東盛生物科技有限公司，限制性核酸內切酶（BamHⅠ、PstⅠ）、T4 DNA 連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司，瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒購自北京諾維森生物科技有限公司，質粒小提試劑盒購自天根生化科技有限公司，氨芐青霉素（Amp）、氯霉素、慶大霉素、青霉素G、溶菌酶、HEPES均購自北京博奧拓達科技有限公司，腦心浸液（brain heart infusion broth，BHI）培養(yǎng)基購自青島高科技園海博生物技術有限公司。

1.1.3 實驗小鼠 6～8周BALB/c小鼠購自石河子大學動物實驗中心。

1.1.4 相關引物 擴增引物、缺失srtA基因的相關引物及缺失株的驗證引物如表1所示。所有引物由北京華大基因公司合成。

1.2 方法

1.2.1srtA基因的克隆與分析 根據(jù)文獻[18]中的煮沸法提取LM分離株LM90SB2的基因組。實驗中所需要的引物見表1。引物srtAF/srtAR 擴增包含srtA基因及其上下游同源臂序列，PCR的反應體系：TaqDNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，dNTP（25 mmol/L）1 μL，10×Buffer 3 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，模板1 μL，ddH2O補足30 μL。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性40 s、60℃退火30 s、72℃延伸100 s，30個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的基因，回收目的片段，連接到pMD19-T（simple）載體，轉化到DH5α感受態(tài)細胞，送北京華大基因公司測序。測序結果與NCBI上已公布LM標準株的全基因序列進行比對分析。

表1 本研究引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 LM90SB2-ΔsrtA缺失株的構建 利用SOE-PCR（splice overlap extension PCR）的方法構建含有srtA基因上下游同源臂的重組質粒[18]，將重組質粒電轉化進入LM分離株LM90SB2中，與基因組中的同源臂進行重組，通過篩選鑒定得到LM90SB2srtA基因缺失株。反應條件：含有引物對srtA1/srtA2的體系退火溫度為53.6℃；含有引物對srtA3/srtA4的退火溫度為59.3℃，其他條件同1.2.1。純化回收PCR產(chǎn)物，用SOE-PCR的方法融合形成886 bp的融合片段ΔsrtA，連接到pMD19-T（simple）載體，轉化入DH5α，送北京華大基因公司測序，篩選出序列正確的陽性質粒pMD19-T-ΔsrtA。質粒pMD19-TΔsrtA和pKSV7經(jīng)PstⅠ和BamHⅠ雙酶切后，經(jīng)連接構建重組質粒pKSV7-ΔsrtA。將獲得的重組質粒pKSV7-ΔsrtA電轉（2.5 kv, 5 ms）至LM90SB2感受細胞態(tài)中，并接種于含有10 μg/mL 氯霉素的BHI平板上進行陽性克隆的篩選。經(jīng)PCR鑒定陽性的克隆接種到含有5 mL BHI培養(yǎng)基（含10 μg/mL 氯霉素）的試管，在41℃、100 r/min的條件下連續(xù)傳代，以srtA1/srtA4、srtA5/srtA6兩對引物來篩選srtA基因缺失株。將srtA基因缺失株接種于5 mL無抗性BHI培養(yǎng)基的試管中，在30℃、100 r/min的條件下連續(xù)傳代，影印接種于BHI-Cl和BHI平板，篩選出不含抗性的LM90SB2srtA基因缺失陽性克隆，并連續(xù)傳代無變化，送至北京華大基因公司測序。

1.2.3 細胞侵染實驗

1.2.3.1 細胞和細菌的培養(yǎng) 采用含有10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和雙抗（100 U/mL青霉素和10 μg/mL硫酸鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)所有細胞。并接種于24孔細胞培養(yǎng)板，置于含37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h使細胞長成單層。挑取單個菌落接種于含有5 mLBHI的試管中，置于37℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)16 h，取培養(yǎng)物8000×g離心5 min收集菌體，PBS洗滌2遍，稀釋細菌于DMEM培養(yǎng)液中，平板計數(shù)，使細菌數(shù)量大約為107CFU/mL，用于感染細胞。

1.2.3.2 細菌對細胞的粘附與侵襲 參考文獻[19-20]中的方法來分析菌株對于細胞的粘附侵襲作用。按照一定的比例（細菌∶內皮細胞=50∶1，細菌∶巨噬細胞=5∶1）用細菌感染24孔細胞培養(yǎng)板中的細胞60 min，使得細菌粘附并侵入細胞。感染結束后，37℃預熱的PBS洗滌細胞2次，去除未粘附細胞的細菌，用0.1 mL 0.25% TritonX-100裂解細胞10 min，用PBS洗滌混旋均勻后，10倍梯度稀釋，平板計數(shù)，計算細菌對細胞的粘附率。細菌感染結束后，37℃預熱的PBS洗滌2次后，加入含有100 μg/mL的慶大霉素的新鮮DMEM置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，殺滅細胞外沒有侵入細胞的細菌，棄培養(yǎng)液PBS洗滌1次，按上述方法裂解細胞、菌落計數(shù)，計算細菌對細胞的侵襲率。

1.2.3.3 細菌在細胞內的增殖 細菌感染細胞60 min后，PBS洗滌2次，加入含有100 μg/mL慶大霉素的DMEM，培養(yǎng)細胞40 min后，裂解細胞，平板計數(shù)，記做t=0。其余加入含有5%FBS和10 μg/mL慶大霉素的DMEM，培養(yǎng)于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，間隔一定的時間（t=2、4、6、8、10和12 h）按上述方法裂解細胞，菌落計數(shù)，繪制細菌在細胞內的生長曲線。

1.2.4 小鼠毒力實驗 6～8周BALB/c小鼠飼養(yǎng)一周，觀察其無異常變化，隨機分組。挑取單菌落接種于BHI培養(yǎng)基中，在37℃、180 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)16 h，菌液于5000×g離心5 min，收集菌體，PBS洗滌2次，懸浮菌體于PBS中，調整各菌株菌量至同一水平，約8×109CFU/mL。將細菌懸液10倍梯度稀釋至8×105CFU/mL，平板計數(shù)確定實際接種量。各梯度的細菌懸液腹腔接種小鼠0.5 mL，每組接種6只小鼠，同時接種PBS為陰性對照組，統(tǒng)計接種后10 d內小鼠死亡數(shù)，用寇氏法計算LD50。將含有5×105CFU/mL的細菌懸液腹腔接種小鼠0.3 mL[21]，每個菌株接種15只小鼠，分別在接種后1、2、3、4 d無菌剖取小鼠肝臟、脾臟和腦，加入1 mL PBS充分研磨制成均勻的組織懸液，用PBS進行10倍梯度稀釋，涂布于亞碲酸鉀平板計數(shù)，挑取菌落用引物對hlyF/hlyR進行PCR鑒定。

1.2.5 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計每組BHI平板計數(shù)結果，細菌粘附率計算公式：（胞內細菌數(shù)＋胞外細菌數(shù)）÷加入孔內的細菌數(shù)×100%。侵襲率計算公式：胞內細菌數(shù)÷加入孔內的細菌數(shù)×100%，而細胞內增殖則用不同培養(yǎng)時間段（2、4、6、8 h等）細胞裂解計數(shù)結果取對數(shù)表示。用軟件 SPSS17.0 采用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 LM分離株LM90SB2 srtA基因的擴增與分析擴增獲得srtA基因的開放閱讀框大小為669 bp（圖1），編碼222個氨基酸，LM90SB2的srtA基因與LM F2365 株（serovar 4b，NC_002973）的srtA基因的核苷酸同源性為100%，與LM EGD-e株所編碼（serovar 1/2a，NC_003210）的srtA基因的核苷酸同源性為94.32%，氨基酸同源性為99.55%，只有第176位的氨基酸由天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔粚儆赟rtA的活性中心和保守區(qū)域。

圖1 LM分離株LM90SB srtA基因 PCR 擴增結果Fig.1 PCR products of srtA gene

2.2 LM90SB2 srtA基因缺失株的構建用SOE-PCR的方法擴增了1個886 bp的srtA基因上下游同源臂，連接到載體pKSV7上，構建pKSV7-ΔsrtA，并將其電轉進入分離株LM90SB2中，含有重組質粒pKSV7-ΔsrtA的LM90SB2菌隨機同源重組形成srtA基因缺失株LM90SB2-ΔsrtA，用引物對srtA5/srtA6進行PCR鑒定。結果顯示，分離株目的條帶為1747 bp，見圖2。缺失株目的條帶為1078 bp，測序結果證實srtA基因缺失。與分離株LM90SB2相比，LM90SB2-ΔsrtA在BHI培養(yǎng)基中37℃條件下生長無差異，連續(xù)傳代后PCR檢測無變化，表明缺失片段具有遺傳穩(wěn)定性。

圖2 LM缺失株LM90SB2-ΔsrtA PCR鑒定Fig.2 Identi fication of recombinant LM90SB2-ΔsrtA by PCR

2.3 LM分離株LM90SB2和缺失株LM90SB2-ΔsrtA對不同種類細胞的感染能力分析LM對細胞的粘附和侵襲與細胞類型有關。分離株LM90SB2對MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附率和侵襲率均不同，粘附率分別為1.2952、0.9740、7.3470、1.4343；侵襲率分別為0.3264、0.4718、3.3610、0.8267（表2）。分離株LM90SB2在不同細胞內的增殖趨勢不同，在MBMEC、RAW264.7中，細菌數(shù)目隨時間呈現(xiàn)一個先下降后上升的趨勢（圖3A和3C）；HBMEC中，不同時間細菌數(shù)目保持相對平穩(wěn)（圖3B）；在SIEC細胞中，細菌數(shù)目隨時間不斷下降（圖3D）。缺失株LM90SB2-ΔsrtA對細胞的粘附和侵襲均較分離株LM90SB2下降（表2）。統(tǒng)計學分析，與分離株LM90SB2相比，缺失株LM90SB2-ΔsrtA對HBMEC、RAW264.7、SIEC的粘附和對MBMEC、RAW264.7、SIEC的侵襲差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 LM分離株LM90SB2和缺失株LM90SB2-ΔsrtA對細胞的粘附和侵襲效率Table 2 Percent of adhesion and invasion results of LM90SB2 strain and LM90SB2-ΔsrtA strain

圖3 LM分離株LM90SB2 (◇WT)和LM缺失株LM90SB2-ΔsrtA (■ΔsrtA)在不同時間點細胞內的細菌數(shù)Fig.3 Numbers of LM90SB2 (◇WT) and LM90SB2-ΔsrtA(■ΔsrtA) in the cells after infection at various time

2.4 srtA基因的缺失對小鼠致病能力的影響小鼠腹腔注射不同濃度的菌液，24 h后小鼠出現(xiàn)死亡，統(tǒng)計小鼠死亡數(shù)，用寇氏法計算LD50，測得LM90SB2-ΔsrtALD50為107.73，分離株LM90SB2的LD50為106.1。結果表明srtA基因缺失后的LM對小鼠的毒力下降了1.63 個對數(shù)級。

與分離株LM90SB2相比，缺失株LM90SB2-ΔsrtA在小鼠肝臟、脾臟中載菌量均顯著減少，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4A和4B），但腦載菌量在感染后第1～3 d的缺失株LM90SB2-ΔsrtA明顯高于分離株LM90SB2，具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），分離株LM90SB2感染3 d后，腦中細菌數(shù)量出現(xiàn)快速增長，在第4 d分離株LM90SB2高于缺失株LM90SB2-ΔsrtA，具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4C）。結果表明，srtA基因缺失后細菌仍然可以感染小鼠并在靶器官中生長繁殖，但是含菌數(shù)量相對分離株發(fā)生了變化，特別是在腦中呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，說明缺失株仍然能穿越血腦屏障，但是srtA基因缺失后影響LM90SB2在腦中的增殖。

圖4 分離株LM90SB2 (◇WT)和缺失株LM90SB2-ΔsrtA (■ΔsrtA)在感染小鼠4 d內肝臟、脾臟、腦中載菌量的變化Fig. 4 Numbers of LM90SB2 (◇WT)and LM90SB2-ΔsrtA (■ΔsrtA) in mice liver, spleen, brain during 4 days

3 討論

LM感染一般經(jīng)胃腸道開始，侵入腸上皮細胞跨越腸道屏障，被單核巨噬細胞吞噬，隨淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)到達肝臟和脾臟，并在肝細胞中繁殖，最后通過血液擴散到腦和胎盤，引起全身性感染；LM通過內化、逃離吞噬泡、利用在宿主細胞內的極向運動實現(xiàn)細胞間直接傳播等方式逃逸宿主的體液免疫應答；這些過程涉及LM的多種毒力因子[22-24]。srtA基因編碼的分選酶，可以識別表面蛋白C端分選信號所含的保守氨基酸基序LPXTG，把蛋白錨定到肽聚糖上，呈現(xiàn)在細菌表面，發(fā)揮毒力作用。

自1996年以來，中國新疆維吾爾自治區(qū)某些地區(qū)的羊群陸續(xù)爆發(fā)一種以神經(jīng)癥狀為主要特征的疾病，死亡率高達70%以上，結合臨床表現(xiàn)，經(jīng)病原分離鑒定，確診為單核細胞增多性李斯特菌引起的綿羊腦炎[17]。構建srtA基因缺失株是研究其基因功能的基礎，我們通過構建LM90SB2-ΔsrtA缺失株，分別在細胞水平和小鼠水平探討srtA基因在LM分離株LM90SB2毒力發(fā)揮中的作用。通過對不同類型細胞的粘附、侵襲及胞內增殖試驗表明，srtA基因缺失可以降低LM90SB2對MBMEC、HBMEC、RAW264.7、SIEC細胞的粘附、侵襲和胞內增殖能力。

SIEC是豬源腸道上皮細胞，缺失株LM90SB2-ΔsrtA對SIEC的粘附和侵襲的能力下降，與Garandeau等[25]報道LM的srtA基因缺失后，對于Caco-2細胞和HepG-2細胞的侵襲力降低相一致，表明LM分離株LM90SB2的srtA基因參與細胞表面蛋白的錨定，但是在SIEC中細菌數(shù)隨時間不斷下降，究其原因：可能是細菌在胞內增殖后，造成SEIC的脫落死亡，裂解計數(shù)前隨細胞培養(yǎng)液一起棄掉；細菌在胞內增殖后，從細胞內釋放出來被培養(yǎng)液中的慶大霉素抑制；或者是細菌還沒有在細胞內增殖和細胞間傳遞，被侵染的細胞隨時間逐漸死亡。

表3 LM分離株LM90SB2和缺失株LM90SB2-ΔsrtA對小鼠LD50測定Table 3 LD50 measurement results of LM90SB2 and LM90SB2-ΔsrtA

LM分離株粘附和侵襲RAW264.7的能力均高于粘附和侵襲SIEC、MBMEC和HBMEC，這可能與RAW264.7為免疫細胞，可以通過其表面的PRR受體和TOLL樣受體等增強對LM90SB2細菌吞噬。LM分離株和缺失株進入RAW264.7后均有一定程度的增殖，表明他們具有一定的抗吞噬細胞消化能力，但是缺失株LM90SB2-ΔsrtA在胞內增殖數(shù)量低于分離株LM90SB2，可能與srtA缺失后，一些抗吞噬細胞消化的蛋白不能表達在細胞表面有關。

LM能引起腦膜炎和腦炎，其中一種方式是穿越血腦屏障（blood brain barrier，BBB），LM穿越血腦屏障的機制目前尚不清楚。BBB主要由內皮細胞間緊密連接、星形膠質細胞、周皮細胞和血管周圍的小膠質細胞以及基膜等結構構成。體外血腦屏障研究主要是腦微血管碎段模型、腦微血管內皮細胞模型、腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞共同培養(yǎng)模型，而培養(yǎng)腦血管內皮細胞是目前國內外常用的血腦屏障模型之一[26-27]。LM90SB2能夠粘附、侵襲腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothellal cell，BMEC），并在其中增殖，可能是LM穿越BBB的方式，srtA基因缺失可以降低LM90SB2對BMEC的粘附、侵襲和胞內增殖，可見SrtA分選的蛋白參與了對BMEC細胞的作用。本次試驗也發(fā)現(xiàn)LM90SB2對HBMEC和MBMEC的粘附有差異，表明細菌對腦細胞的侵染存在種屬特異性，這可能與不同種屬來源細胞其表面受體不同有關[26,28-32]。

LM90SB2-ΔsrtA對小鼠LD50比LM90SB2降低了21.38倍，說明LM90SB2-ΔsrtA的毒力明顯下降，并且在感染后4 d內，肝臟、脾臟和腦中的載菌量始終低于LM90SB2，表明srtA基因的缺失會影響LM90SB2在各臟器中的增殖。

本研究結果表明，srtA基因缺失并沒有使LM90SB2喪失對小鼠的致病性和毒力，可見SrtA分選的蛋白只部分參與了細菌的致病力。盡管SrtA參與了眾多C端含有分選信號的表面毒力蛋白錨定到細胞表面的過程，可能細菌本身還存在其他類似蛋白分擔SrtA的作用，或是srtA基因缺失后激活了相似蛋白發(fā)揮補償作用，保證其生長，或者是srtA基因缺失后，使得某些蛋白的分泌特點發(fā)生了變化，一些由SrtA轉運的蛋白，通過其他方式呈現(xiàn)在細菌表面發(fā)揮了毒力作用。這方面的研究需要我們進一步去探索。