黛礬散對原發(fā)性膽汁性膽管炎小鼠肝細胞膜多重藥物抗性相關蛋白2的影響*

程良斌嚴駿松 周金輝

1.湖北省中醫(yī)院肝病研究所 (湖北 武漢， 430061) 2.武漢市第六醫(yī)院消化科 3.上海市閔行區(qū)中醫(yī)院消化科

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)，又名原發(fā)性膽汁性肝硬化，是一種病因不明的慢性進行性的膽汁淤積性肝病，其典型病理表現為非化膿性膽管炎或肉芽腫性膽管炎，以小膽管破壞為主。治療方面，除熊去氧膽酸(UDCA)的療效受到肯定外暫無特效治療；而中藥在治療該病的臨床實踐中取得了一定療效。根據PBC的臨床表現，本病當屬中醫(yī)黃疸病的“瘀黃疸癥”范疇，血瘀血熱、瘀熱交阻常為膽汁淤積的成因。我們前期的研究證實，中藥黛礬散及組分能不同程度拮抗α-奈異硫氰酸脂所致膽管損傷引起的肝內膽汁淤積[1]。為進一步探究黛礬散治療PBC的機理，我們擬采用聚肌胞苷酸(PolyⅠ:C)誘導PBC小鼠模型，觀察黛礬散及其各組分對其肝臟血清學生化、肝臟組織學改變及肝細胞多重藥物抗性相關蛋白2(MRP2)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雌性C57BL/6小鼠60只，體重(20±2)g，由湖北省醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(鄂)2015-0018。

1.2 主要試劑及藥物 PolyⅠ:C購自美國Sigma公司(批號：31852-29-6)，用之前以無菌PBS稀釋至1 mg/ml；黛礬散(青黛和明礬比例1:8)由湖北省中醫(yī)院藥劑科提供，用之前以1%阿拉伯膠配成相應濃度，熊去氧膽酸(UDCA)為德國LosanPharma GmbH產品(批號：H20050181)，用之前以1%阿拉伯膠配成5mg/ml溶液。

1.3 分組與處理 實驗動物隨機分為6組，每組10只，分別為正常組(A)、模型組(B)、明礬組(C)、青黛組(D)、黛礬散組(E)及熊去氧膽酸組(F)。除A組小鼠外，其余5組小鼠以poly I∶C腹腔注射(5mg/kg)，1次/3天，A組小鼠以等體積的生理鹽水腹腔注射，連續(xù)16周。A、B組小鼠以1%阿拉伯膠灌胃(0.1ml/kg/d)，C組小鼠以青黛灌胃(0.12g/kg/d)，D組小鼠以明礬灌胃(0.96g/kg/d)，E組以黛礬散灌胃(1.08g/kg/d)，F組以熊去氧膽酸灌胃(15mg/kg/d)，連續(xù)16周。16周后處置動物，采血分離血清，留取肝組織制備肝勻漿和病理切片。

1.4 檢測指標及方法 常規(guī)生化檢測血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)；采用酶聯免疫吸附劑測定法(ELISA)檢測抗線粒體抗體(AMA)，觀察肝組織病理變化，采用RT-PCR方法檢測多重藥物抗性相關蛋白2(MRP2) mRNA表達水平,采用Western-blot方法檢測MRP2蛋白表達水平。

2 結果

2.1 各組小鼠血清生化指標檢測結果 見表1。

2.2 各組小鼠MRP2基因mRNA水平 見表2。

表1 各組小鼠生化指標檢測結果比較

與正常組比較， *P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 各組小鼠MRP2基因mRNA比較

與正常組比較， *P<0.05；與模型組比較， △P<0.05

2.3 各組小鼠MRP2蛋白表達情況 與正常組比較，模型組MRP2水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，各治療組分別有不同程度的升高，其中黛礬散組和熊去氧膽酸組升高顯著(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠MRP2蛋白電泳圖

2.4 各組小鼠肝組織病理學變化 A組小鼠肝細胞排列整齊，門管區(qū)無明顯病變；B組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細胞浸潤及纖維組織輕度增生，向周圍肝組織穿插，呈早期肝硬化趨勢；C組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細胞浸潤；D組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細胞浸潤、血管擴張；E組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞普遍中-重度變性，門管區(qū)炎癥細胞浸潤、纖維組織輕度增生；F組小鼠肝小葉結構存在，肝細胞普遍中-重度變性，門管區(qū)少許炎癥細胞浸潤、小膽管增生。見插頁彩圖2。

圖2 各組小鼠肝組織病理圖（HE，×100）

3 討論

PBC的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前已知其機制與免疫、遺傳易感性、化學物質及感染因素相關。在治療方面，目前UDCA是唯一被國際指南均推薦用于治療PBC的藥物[2]，對UDCA生物化學應答欠佳的患者，目前尚無統(tǒng)一治療方案[3],奧貝膽酸(obeticholic acid)是近年來研究的治療PBC的新藥，可顯著改善PBC患者的生化指標，但嚴重不良事件的發(fā)生率也較高[4]，肝臟移植是治療終末期PBC唯一有效的方式。我國有關PBC的研究正處于起步階段，PBC患者的臨床表現多以乏力及皮膚瘙癢最為常見，當屬中醫(yī)“瘀黃疸癥”的范疇，血瘀、血熱、瘀熱交阻常為膽汁淤積的成因[5]。我們前期的臨床研究表明，運用中藥黛礬散在治療肝內膽汁淤積癥具有良好的臨床療效及安全性[6]；而我們前期的動物實驗結果表明，黛礬散能顯著降低雌激素所致肝內膽汁淤積大鼠的TBA、TBil、ALT及ALP水平，增強肝勻漿及肝竇膜中Na+-K+-ATPase、Mg++-ATPase活性，且可加強肝細胞竇膜及毛細膽管膜的流動性[7，8]；黛礬散及其組分能不同程度拮抗ANIT所致膽管損傷所導致的肝內膽汁淤積[1]。

MRP2主要在肝細胞表達，定位于毛細膽管面，主要負責膽紅素和其它膽汁成分的排泄。各種因素導致其缺陷可引起高膽紅素血癥和膽汁流的障礙。陳應果[9]等人的研究表明，梗阻性黃疸大鼠其MRP2在轉錄和蛋白表達水平均明顯降低，肝細胞對膽紅素的排泄障礙，導致或進一步加重機體的高膽紅素血癥;國外研究也表明，在膽汁淤積模型中，MRP2的轉錄和表達均降低[10]。本文的實驗結果表明，青黛組、礬石組、黛礬散組及UDCA組AMA、ALP均較模型組顯著降低，MPR2的轉錄和表達水平較模型組也有不同程度的升高；病理結果示：黛礬散及其組分能不同程度拮抗PolyⅠ:C誘導的門管區(qū)炎癥及膽管上皮損傷。綜上所述，黛礬散及其組分能不同程度促進應用PolyⅠ:C 建立的PBC小鼠模型的MRP2基因的轉錄和蛋白表達，這可能是黛礬散治療PBC的藥理學作用機制之一。