復制蛋白A1和A2在肝細胞癌患者癌組織中的表達及臨床意義*

王肖澤 田學軍 蒙 軒

1.清華大學玉泉醫(yī)院普外科 (北京， 100040) 2.中國人民解放軍總醫(yī)院肝膽外科

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占癌癥死亡的第二位，在我國原發(fā)性肝癌的發(fā)病率較高，給醫(yī)療資源及患者生活帶來較大負擔[1]。原發(fā)性肝癌根據(jù)病理組織來源，常規(guī)可分為3類肝內(nèi)膽管癌、混合性肝癌以及肝細胞癌，其中超過90.51%的患者為肝細胞癌[2,3]。雖然原發(fā)性肝癌的臨床診治技術和相關研究均取得了較大進步，但仍有大量患者因為病情反復或治療無效而死亡。隨著分子疾病學的不斷發(fā)展，眾多學者開始將基礎疾病的發(fā)病機制與人體細胞通道或蛋白分泌通道相聯(lián)系。有研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌的產(chǎn)生與人體“三多因素(多蛋白、多基因、多步驟)”有關[4]，其中復制蛋白A(RPA)是在DNA代謝過程中發(fā)揮重要作用的主要真核細胞結合蛋白(單鏈DNA)，但是RPA各亞單位如何具體影響疾病發(fā)生和進展，仍需進一步研究[5～7]。本研究探討RPA在肝細胞癌患者癌組織中的表達及臨床意義，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 隨機選取2018年1月至2018年6月期間，在我院治療的肝細胞癌患者60例。納入標準：患者經(jīng)病理證實為肝細胞肝癌；暫時未接受過任何治療；肝功能Child-Pugh A級或B級；暫無其他部位轉(zhuǎn)移；無重要器官損害；患者均簽署知情同意書。排除標準：患有其他惡性腫瘤(或其他類型肝癌)者；存在明顯凝血功能障礙者；患有其他疾病，病情危重而不宜手術者；精神或意識不正常，無法配合正常手術的患者。另有30例肝臟良性腫瘤手術患者作為對照組，在術中留取肝組織待測。

1.2 檢測項目及方法 ①采集患者入院初基本情況包括性別、肝癌細胞分化程度、TNM分期、乙肝病毒表面抗原、淋巴結轉(zhuǎn)移及門脈癌栓等情況。②比較不同預后患者治療前后RPA1、RPA2表達含量，根據(jù)改良實體瘤療效評價標準(CIST)進行預后評估，分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進展。③RPA1、RPA2含量檢測：組織穿刺或術中留取組織來取得標本，包括癌組織或正常組織，當即用生理鹽水洗凈后放入凍存管(提前放入去RNA酶)中進行低溫保存。采用Western blotting方法進行檢測，取樣品中80.0mg組織，提取蛋白，按照BCA試劑盒(碧云天生物技術研究所)說明書進行操作，最后利用SDS-PAGE電泳進行轉(zhuǎn)模、封閉及顯色。取出條帶晾干，照相。將膠片進行掃描(或高清拍照)，測定目的條帶的灰度值，用以表示RPA1、RPA2的含量。

2 結果

2.1 兩組患者RPA1和RPA2表達情況 見表1。

2.2 不同情況肝細胞癌患者RPA1表達情況 見表2。

2.3 不同情況肝細胞癌患者RPA2表達情況 見表3。

2.4 不同預后的肝細胞癌患者RPA1和RPA2表達情況 見表4。

表1 肝癌患者與健康人群RPA1、RPA2表達比較

表2 不同情況肝細胞癌患者RPA1表達水平比較

與TNMⅠ期比較，*P<0.05；與有淋巴結轉(zhuǎn)移比較，△P<0.5

表3 不同情況肝細胞癌患者RPA2表達水平比較

與低分化比較，#P<0.01；與TNMⅠ期比較，*P<0.05；與有門脈癌栓比較，★P<0.05

表4 不同預后的肝細胞癌患者RPA1、RPA2表達水平比較

3 討論

肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展、以及轉(zhuǎn)移，與細胞的損傷修復過程密切相關，多位學者提出，人體的多種抑癌基因(P53、APC、Rb)和原癌基因都參與其中[8～10]。在DNA延長和復制起始階段，RPA蛋白發(fā)揮著關鍵作用，也有研究發(fā)現(xiàn)[11,12]，在DNA的損傷修復階段RPA也起著重要作用。因此，基因組的不穩(wěn)定與腫瘤的發(fā)生有著密切關系，而在肝細胞癌發(fā)展過程中腫瘤細胞的異常生長需要DNA的大量復制和充足的修復能力[13,14]，所以，我們可以推斷RPA1、RPA2參與了肝癌的形成。本研究分析RPA1、RPA2在肝細胞癌和肝臟良性腫瘤患者肝癌組織中的表達情況，結果表明肝細胞癌患者RPA1和RPA2的表達高于肝臟良性腫瘤患者，且前者的高表達與患者的性別、HBV感染，有無淋巴結轉(zhuǎn)移等無關，而與癌細胞分化程度、TNM分期、門脈癌栓存在一定關聯(lián)。肝癌細胞分化程度越高、腫瘤分期為Ⅲ、Ⅳ期以及有門脈癌栓的患者肝癌組織中RPA1、RPA2表達更高，提示肝細胞癌患者病情越嚴重，其RPA1、RPA2表達水平相對越高。近年來有研究證實，RPA(特別是RPA2)能夠與P53抑癌基因相互作用，導致野生型P53抑癌基因的活性下降，使得受損的DNA通過細胞周期的檢測，腫瘤細胞更容易形成[15～18]。同時，RPA可以直接影響到堿基切除修復、核苷酸切除修復、雙鏈斷裂修復三個主要過程，進而影響到腫瘤細胞異常生長時DNA三大過程(復制、修復、凋亡)，還可影響到腫瘤細胞的生理活性及疾病的病理特征。因此，我們認為RPA1、RPA2的高表達能夠作為判斷肝細胞癌惡性程度及患者預后的重要參考指標。對這兩個特異性蛋白表達水平進行實時監(jiān)測，有助于了解患者病情，并預測其發(fā)展[19～21]。有研究顯示，肝細胞癌患者體內(nèi)TNF-α、甲胎蛋白等炎性因子均會有顯著上升，而miR-590-5p和miR-590-3p等基因表達也有明顯增加，至于RPA1、RPA2水平與上述指標是否存在聯(lián)系，仍需進行深入研究。

隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，肝細胞癌的治療方法逐漸增多，包括手術、局部消融、介入治療、放療、藥物治療等，術后總生存率也有所提高，但最新的研究結果顯示，肝癌仍是預后最差的一種腫瘤[22～24]。本研究結果顯示，預后不樂觀的患者肝癌組織中RPA1、RPA2表達水平顯著高于預后完全緩解的患者，由此，也可以將RPA1、RPA2水平作為判斷肝癌患者預后緩解的一個指標。從另外一個角度來說，我們可以嘗試通過分子靶向治療技術，對肝細胞癌患者的臨床治療進行新的嘗試。分子靶向治療是近些年迅速發(fā)展的一種腫瘤治療方式，其作用機理為利用腫瘤細胞與健康細胞間的分子生物學差異，采用一系列措施靶向性地抑制腫瘤細胞生長，加速腫瘤細胞死亡[25]。有研究表明RPA可能是細胞毒性藥物的靶點，本研究的結果也證實RPA的表達與癌組織間有著密切關系，但由于本研究所納入的病例數(shù)有限，并不能得出確切結論，RPA1、RPA2表達水平能否作為肝細胞癌惡性程度評估的重要指標仍需進一步深入研究。