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    三種不同品牌ELISA試劑盒檢測ASCA的結(jié)果比較及性能評估

    2019-09-06 09:07:54余悠悠曾俊祥潘秀軍
    關(guān)鍵詞:試劑靈敏度一致性

    余悠悠, 曾俊祥, 羅 婷, 鄧 琳, 潘秀軍

    (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科,上海 200092)

    炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,主要包括克羅恩?。–rohn's disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸(ulcerative colitis,UC)。 近年來我國IBD的發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。目前,IBD的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,可能與遺傳、環(huán)境、感染、免疫等因素相關(guān)[2-3]??贯劸平湍缚贵w(anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies,ASCA)在國際上已被認(rèn)可是IBD特異性的血清學(xué)抗體之一[4],其在CD鑒別診斷方面的價值目前也已得到了世界胃腸病學(xué)組織的肯定[5]。在國內(nèi)ASCA也日益得到重視,但國內(nèi)的研究結(jié)果存在很大爭議,尚未達(dá)成共識[6-7],這給臨床推廣工作帶來一定的障礙。目前,ASCA實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)主要包括間接免疫熒光法(indirect immunofluoescence,IIF)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。本研究選取了市場上3個試劑廠家的ASCA-ELISA試劑盒進(jìn)行臨床樣本的檢測,分析檢測結(jié)果之間的一致性,比較各試劑盒的檢測性能,評估ASCA在IBD診斷和鑒別診斷中的價值,以期為該指標(biāo)的臨床應(yīng)用提供有效參考。

    資料與方法

    一、資料

    1.IBD患者組:140例IBD患者中,CD患者87例,UC患者53例,為2016年6月至2017年11月期間在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科、肛腸外科住院的確診患者,診斷均符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012年,廣州)》[6]。

    2.疾病對照組(disease control,DC):DC 組 40 例患者包括急性感染性腸炎、腸息肉、腸結(jié)核、腸易激綜合征等,主訴為均腹痛、腹瀉,后經(jīng)內(nèi)鏡排除IBD。

    本研究通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(No.XHEC-D-2017076),所有研究對象均簽署知情同意書。

    二、方法

    1.血標(biāo)本的采集:經(jīng)患者知情同意后,抽取空腹靜脈血5 mL,置有分離膠的真空管,待室溫凝固后,采用3 000 r/min,常溫離心5 min,分離血清,均放置于-80℃儲存、備用。

    2.試劑和方法:ASCA-IgA和ASCA-IgG檢測采用ELISA方法,試劑盒分別采用一家國產(chǎn)品牌試劑A[抗釀酒酵母IgA/IgG抗體定量檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)96人份,山西瑞豪生物科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號 IBDB16112901、IBDC16112901];二家進(jìn)口品牌試劑B、C[試劑B為抗釀酒酵母IgA/IgG抗體檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫法)96人份,美國INOVADiagnostics,Inc.生產(chǎn), 生產(chǎn)批號 031113、029392;試劑C為抗釀酒酵母IgA/IgG測定試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)96人份,德國EUROIMMUN公司生產(chǎn);生產(chǎn)批號CE160504AV、CE160504CG]。標(biāo)準(zhǔn)品和陰、陽性質(zhì)控物均采用各試劑盒配套產(chǎn)品,操作步驟嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行檢測,分別根據(jù)各試劑盒說明書提供的臨界值判斷結(jié)果。

    3.使用儀器:洗板采用科華ST-36WT全自動洗板機(jī),在Thermo酶標(biāo)儀上讀取及采集數(shù)據(jù)。

    三、統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法;對3種試劑盒檢測的結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa檢驗(yàn),根據(jù)Kappa值定義一致性強(qiáng)弱程度,當(dāng)Kappa<0,一致性強(qiáng)度極差;0~0.2,微弱;0.21~0.40,弱;0.41~0.60,中度;0.61~0.80,高度;0.81~1.00,極強(qiáng)[8]。 以臨床和(或)病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn),采用四格表分別計算ASCA-IgA、IgG和ASCA-IgA和 (或)IgG診斷IBD的靈敏度、特異度及約登指數(shù),并采用MedCal Version 15.22進(jìn)行3種試劑盒受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析,通過分析曲線下面積(area under curve,AUC)評判各試劑盒的診斷效能。 當(dāng) AUC 接近 0.5 時,表示無診斷價值,AUC<0.7表示診斷準(zhǔn)確率較低,AUC 在 0.7~0.9表示診斷準(zhǔn)確率中等,AUC>0.9時表示診斷有較高的準(zhǔn)確率[9]。

    表1 3種ELISA試劑盒檢測ASCA的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較

    表2 3種試劑檢測ASCA-IgA和(或)ASCA-IgG總陽性率比較[n(%)]

    結(jié) 果

    一、3種ELISA試劑盒檢測ASCA的主要實(shí)驗(yàn)參數(shù)比較

    列表比較3種ELISA試劑盒檢測的幾項(xiàng)主要實(shí)驗(yàn)參數(shù),關(guān)于臨界值的建立,因?yàn)樯袩oASCA的國際參考血清,與國際通用單位之間的關(guān)系并未驗(yàn)證,所以暫無國際標(biāo)準(zhǔn)單位,各試劑盒按自身實(shí)驗(yàn)室結(jié)果設(shè)立(見表1)。

    二、3種試劑檢測ASCA-IgA和 (或)ASCA-IgG總陽性率結(jié)果比較

    ASCA-IgA和ASCA-IgG兩者有1項(xiàng)結(jié)果陽性或2項(xiàng)同時陽性即作為ASCA-IgA和 (或)ASCAIgG陽性。同一種試劑在CD組中的檢出率均高于UC 組及 DC 組(P<0.05),而在 UC 組的陽性檢出率與 DC 組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同一組別不同試劑的陽性檢出率情況顯示,3種ELISA試劑在UC組及DC組中陽性檢出率無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而在 CD 組中,試劑 A 與試劑 B 檢測結(jié)果之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而試劑C的陽性檢出率低于試劑 A 及試劑 B(P<0.05)(見表 2)。

    三、3種試劑盒對同一批樣本的檢測結(jié)果一致性評價

    根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會EP12-2A文件對3種試劑的總樣本檢測結(jié)果作一致性分析,ASCA-IgA兩兩比較的一致性為,試劑A與B、試劑B 與 C、試劑 A 與 C 的 Kappa值分別為 0.423、0.074和0.111,前一組為中等一致性,后2組為極低一致性;3種試劑ASCA-IgG兩兩比較的,試劑A與B、試劑B與C、試劑A與C的Kappa值分別為0.414、0.447 和 0.584,3 組結(jié)果均為中等一致性(見表 3)。

    四、3種ELISA試劑檢測ASCA的性能比較

    分析評價3種試劑檢測ASCA的結(jié)果對IBD的診斷能力,統(tǒng)計3種試劑盒在ASCA-IgA、ASCAIgG及ASCA-IgA和 (或)ASCA-IgG這3種情況下的靈敏度、特異度以及約登指數(shù),并采用ROC曲線分析得出各組AUC,評判各試劑盒的診斷準(zhǔn)確性。結(jié)果顯示,3種試劑檢測IgG和IgA抗體時的靈敏度都欠佳,但聯(lián)合檢測2種抗體的靈敏度都高于單項(xiàng)檢測;ASCA-IgA的特異度相對較高,其中試劑C最高為97.5%;ASCA-IgA中試劑A的AUC面積最大為0.72,ASCA-IgG中試劑B的AUC面積最大為0.72,ASCA-IgA和(或)ASCA-IgG的結(jié)果AUC面積最大為試劑B的0.69。結(jié)合以上各項(xiàng)約登指數(shù),比較3種試劑的檢測性能,試劑盒B綜合效能最佳,試劑盒A次之,試劑盒C較低(見表4、圖1)。

    表3 3種試劑盒ASCA-IgA和ASCA-IgG檢測結(jié)果一致性比較

    表4 3種試劑盒主要檢測指標(biāo)診斷效能

    圖1 ASCA-IgA、ASCA-IgG及ASCA-IgA和(或)ASCA-IgG檢測結(jié)果ROC曲線

    討 論

    IBD是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,主要包括CD和潰瘍性結(jié)腸UC,是北美和歐洲的常見病,但近十余年來本病就診人數(shù)在我國呈逐步增加,趨勢非常明顯,已成為消化系統(tǒng)常見病[1]。IBD的診斷取決于臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡、組織學(xué)、放射學(xué)等,而內(nèi)鏡檢查為侵入性,耗時且有時不被患者接受[10]。特別是在患者的臨床表現(xiàn)、內(nèi)鏡和病理特征不典型或有疑惑時,還可能會出現(xiàn)漏診或誤診現(xiàn)象[9],這會給個人和社會的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)支出帶來沉重的負(fù)擔(dān),因此早期診斷并盡早干預(yù)是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵[11],IBD相關(guān)血清生物學(xué)標(biāo)志物的出現(xiàn)有望彌補(bǔ)、甚至部分解決這一問題[12]。

    ASCA是國外報道最早的且最具特征性的應(yīng)用于IBD診斷及鑒別診斷的血清學(xué)指標(biāo)之一[10,13]。2010年最新亞太消化學(xué)會炎癥性腸病學(xué)組推出的關(guān)于IBD診斷與治療的共識意見[2]中也將ASCA列為一項(xiàng)鑒別CD與UC的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,每種試劑在CD組中的陽性率都明顯高于UC組及DC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這與國外Vermeire等[14]、Herszényi等[15]、國內(nèi)張蜀瀾等[16]的研究結(jié)果相符,表明ELISA檢測ASCA的結(jié)果有利于 UC、CD的鑒別。但同時,該結(jié)果在國內(nèi)仍存在爭議,高翔等[17]的結(jié)果顯示,ASCA檢測陽性率在CD患者僅為11.8%,而UC患者為58.6%。此外,袁柏思等[18]的研究中,ASCA在CD患者中的陽性率也較低,且以上2項(xiàng)研究之間的結(jié)果也不盡一致,與本研究結(jié)果更是大相徑庭。分析發(fā)現(xiàn),他們皆采用的是間接免疫熒光法檢測ASCA。檢測方法的不同可能是造成這種差異的主要原因。

    本文分析3種ELISA試劑盒在各組中檢測的結(jié)果一致性,總體來說ASCA-IgG的一致性較好,ASCA-IgA的一致性不甚理想。分析導(dǎo)致這種差異的原因有以下幾點(diǎn)。①不同生產(chǎn)單位ELISA板的原料、制作工藝不同。②不同廠家抗原的來源,用量及純化方式的差異,或各廠家包被技術(shù)的差異。③抗原本身的復(fù)雜性和可能存在的交叉反應(yīng)。④本文結(jié)果顯示,試劑A與試劑B的一致性較高,而與試劑C的結(jié)果差異較大,試劑盒C酶結(jié)合物使用的是兔抗人抗體,其他2種是羊抗人抗體,考慮可能是酶標(biāo)記抗體的種類不同導(dǎo)致了更大的結(jié)果差異。

    有報道稱,ASCA診斷CD的靈敏度和特異度分別為33%和83%,且靈敏度與特異度呈負(fù)相關(guān)[19],本研究則通過靈敏度、特異度、約登指數(shù)和AUC等指標(biāo)來評估3種試劑盒對IBD的鑒別診斷效能,發(fā)現(xiàn)也存在這樣的情況,3種試劑盒單獨(dú)檢測IgA和IgG的靈敏度均較低,特異度相對較高,約登指數(shù)也較低。因此,不推薦將單一抗體指標(biāo)作為IBD的篩查方法,容易漏診,若同時檢測2種抗體,則檢測靈敏度有所提高,有利于IBD的檢出,以試劑B最優(yōu)。就特異度而言,ASCA-IgA的特異度總體優(yōu)于ASCA-IgG,試劑C的ASCA-IgA結(jié)果特異度最高,用于診斷時的誤診率可能較低。ROC曲線結(jié)果顯示,試劑B的各項(xiàng)檢測結(jié)果AUC都較高。因此,綜合來說,試劑B的診斷效能相對較佳,而試劑A作為國產(chǎn)試劑,與進(jìn)口試劑B相比,其主要診斷效能比較接近,填補(bǔ)了國內(nèi)慢性IBD檢測產(chǎn)品的空白,且其更具有價格優(yōu)勢,樹立了國產(chǎn)試劑在自身免疫檢測領(lǐng)域健康快速發(fā)展的信心與驕傲。

    總之,3種試劑盒ASCA的ELISA檢測結(jié)果對IBD的陽性診斷價值有限,不適合IBD的人群篩查,但在CD的鑒別診斷方面具有一定的臨床應(yīng)用價值;3種試劑盒各有特點(diǎn),但檢測結(jié)果尚存在一定的差異;國產(chǎn)試劑在此領(lǐng)域也具有一定的競爭力,在實(shí)際應(yīng)用中,可根據(jù)具體情況合理選用。

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