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    分散固相萃取法測定黃瓜中的喹啉銅殘留量

    2019-09-05 17:26:44陳思宇王明月林冰呂岱竹
    熱帶作物學(xué)報 2019年7期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜法黃瓜

    陳思宇 王明月 林冰 呂岱竹

    摘 ?要 ?建立了分散固相萃?。╠-SPE)-高效液相色譜(HPLC)分析測定黃瓜中喹啉銅殘留量的方法。樣品采用乙腈和0.1 mol/L鹽酸混合溶液提取,C18填料凈化,高效液相色譜儀分離,紫外檢測器檢測。其色譜條件為:色譜柱SunFireC18(4.6×150 mm,5 ?m),流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液乙腈(65∶35)體系,流速0.6 mL/min,檢測波長250 nm。結(jié)果表明:在0.02、0.2、2 mg/kg三個添加水平下,喹啉銅回收率在92.3%~107.7%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.0%~7.7%之間。該方法操作簡單、靈敏度和準(zhǔn)確度高,能夠用于黃瓜中喹啉銅的殘留分析。

    關(guān)鍵詞 ?黃瓜;喹啉銅;分散固相萃取;高效液相色譜法

    中圖分類號 ?X839.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

    Abstract ?A high performance liquid chromatography (HPLC) coupled with the dispersive solid phase extraction (d-SPE) method for the determination of oxine-copper residue in cucumber was established. The sample was extracted by acetonitrile and hydrochloric acid (0.1 mol/L). The extract was purified by C18. The analysis was carried out by phosphate buffer saline (PBS) and sodium dodecyl sulfate (SDS) -acetonitrile (65∶35) at a flow rate of 0.6 mL/min on SunFireC18 (4.6×150 mm, 5 ?m) column, and detected by HPLC with UV detector at a ultraviolet absorption wavelength of 250 nm. The recovery was in 92.3%107.7% with relative standard deviation (RSD) of 2.0%7.7% at spiked levels of 0.02, 0.2 and 2 mg/kg. The method is simple, sensitive and accurate, and could be used in the determination of oxine-copper residue in cucumber.

    Keywords ?Cucumis sativus L.; oxine-copper; dispersive solid phase extraction; high performance liquid chromatography

    DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.029

    8-羥基喹啉銅(oxine-copper,簡稱為喹啉銅)是黃瓜上常用的一種廣譜、高效、低毒的有機(jī)銅螯合物殺菌劑,噴施后在植物表面形成藥膜,釋放殺菌的銅離子,可有效抑制病菌的萌發(fā)和侵入,對梨、蘋果、黃瓜、西瓜和番茄等作物真菌和細(xì)菌性病害起到預(yù)防和治療作用[1-2]。喹啉銅的使用雖然可以減少農(nóng)業(yè)病蟲害,但過量使用會造成農(nóng)藥殘留,通過食物被人體吸收,銅在人體內(nèi)達(dá)到一定濃度時可形成羥基自由基的催化劑,造成人體DNA的損傷,誘發(fā)癌細(xì)胞的生成[3],世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將喹啉銅歸為第三類致癌物質(zhì)[4]。因此建立準(zhǔn)確快速的喹啉銅殘留檢測方法,是評價蔬菜水果中喹啉銅殘留風(fēng)險和監(jiān)管農(nóng)產(chǎn)品市場的必要手段。喹啉銅的傳統(tǒng)測定方法有氧化-還原滴定法[2],該方法是通過目測顏色變化確定終點(diǎn),準(zhǔn)確度不高,需要大量人力及分析時間,不適于大批量樣品的檢測。喹啉銅主要檢測方法有氣相色譜法,姚杰等[5-6]采用氣相色譜法測定蘋果中喹啉銅的殘留量,該方法需要將喹啉銅進(jìn)行化學(xué)衍生反應(yīng),通過檢測生成的8-羥基喹啉含量計算喹啉銅含量,前處理操作復(fù)雜耗時。高效液相色譜法測定喹啉銅殘留量有相關(guān)報道[7-11],肖浩等[12]和周夢春等[13-14]采用高效液相色譜測定稻田、番茄、黃瓜和土壤樣品中喹啉銅殘留量,以液液萃取的凈化方法進(jìn)行提取,正相和反相兩次萃取之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,凈化操作繁瑣。針對這一點(diǎn),本研究優(yōu)化了提取和凈化方法,采用乙腈加少量鹽酸進(jìn)行提取,減少了提取劑用量和提取時間;用分散固相萃取替代液液萃取凈化的方法,操作簡單、凈化效率高;同時采用十二烷基硫酸鈉離子對磷酸鹽緩沖液流動相體系,能使喹啉銅與雜質(zhì)更好地分離,從而建立了黃瓜中喹啉銅殘留量簡單、快速、準(zhǔn)確的分析測定方法。

    1 ?材料與方法

    1.1 ?材料

    Waters e2695高效液相色譜儀和2489紫外檢測器,美國沃特世公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng),德國默克密理博公司;CR22N落地式高速冷凍離心機(jī),日本日立公司;AL204電子天平,上海梅特勒·托利多儀器有限公司;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;UMV-2多管旋渦混合器,北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

    98.2%喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品,德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈(色譜純),賽默飛世爾科技有限公司;二甲基甲酰胺和85%磷酸(分析純),廣州化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鈉(分析純),汕頭市光華化學(xué)廠有限公司;十二烷基硫酸鈉(分析純),F(xiàn)arco Chemical Supplies;鹽酸(優(yōu)級純),廣州化學(xué)試劑廠;多壁碳納米管(MWCNTs)和C18填料,上海安譜實驗科技股份有限公司;PSA填料,深圳藍(lán)色海貝公司;實驗用水均為一級水。

    1.2 ?方法

    1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?稱取5 mg喹啉銅,以二甲基甲酰胺超聲溶解并定容至100 mL,得到50??g/mL的喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用乙腈稀釋至0.01、0.05、0.1、0.5、1.5 ?g/mL 5個濃度;以喹啉銅的濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.2 ?樣品的提取與凈化 ?稱取10 g黃瓜樣品于50 mL塑料離心管,加入14 mL乙腈和1 mL 0.1?mol/L的鹽酸,渦旋10 min,加入10 g氯化鈉,渦旋1 min,以8000 r/min離心5 min。

    稱取50 mg C18填料于15 mL塑料離心管,加入上述上清液5 mL,渦旋1 min,以8000 r/min離心5 min,上清液待上機(jī)測定。

    1.2.3 ?高效液相色譜檢測條件 ?紫外檢測器(UVD);SunFireC18色譜柱(4.6×150 mm,5??m);進(jìn)樣量10 ?L,柱溫25?℃,十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液為2.5 mmol/L磷酸二氫鈉+1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液,用磷酸調(diào)pH至3.0;流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈(65∶35)體系,流速0.6 mL/min,檢測波長250 nm。在此條件下,喹啉銅的保留時間為6~8 min。

    1.3 ?數(shù)據(jù)處理

    以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣,待測農(nóng)藥的濃度(?g/mL)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定線性范圍,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算相關(guān)系數(shù),證明在實驗條件范圍內(nèi)儀器響應(yīng)與進(jìn)樣濃度呈線性關(guān)系。以保留時間進(jìn)行定性分析,以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

    2 ?結(jié)果與分析

    2.1 ?方法的線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

    在上述條件下以喹啉銅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo),在0.01~1.5 ?g/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系為y=221 000x3 700,r2=0.998。通過在黃瓜空白樣品添加喹啉銅0.02、0.2、2 mg/kg 3個濃度、每個濃度5個平行的加標(biāo)回收實驗,加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表1,色譜圖見圖1。結(jié)果表明,喹啉銅不同添加濃度的回收率在92.3%~107.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.0%~7.7%,用添加法測定喹啉銅的最低含量,得出黃瓜中喹啉銅的檢出限(LOD)為0.08?mg/ kg,最大殘留限量(MRL)為2 mg/kg,因此該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。

    2.2 ?提取條件的優(yōu)化

    喹啉銅不溶于多數(shù)有機(jī)溶劑,微溶于稀酸、吡啶等,在水中溶解度也很小,僅為0.0001%。因此本方法采取在乙腈中加入酸的方式對黃瓜中喹啉銅進(jìn)行提取率的實驗,結(jié)果見圖2。從圖2可以看出,用乙腈提取的黃瓜空白樣品,在目標(biāo)物保留時間處有雜峰干擾,而用鹽酸乙腈溶液提取的無雜峰干擾,說明加入一定濃度的鹽酸可去除部分雜質(zhì),從而提高了準(zhǔn)確度。同時考察了乙腈中加入不同濃度鹽酸對回收率的影響,結(jié)果見圖3。當(dāng)樣品中喹啉銅添加水平為0.1 mg/kg,濃度較高時,直接用乙腈和乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取沒有太大的差別,回收率均為94.5%,乙腈加入0.5 mol/L和2 mol/L鹽酸提取,回收率偏低,分別為45.0%和39.0%;當(dāng)樣品中喹啉銅添加水平為0.02?mg/ kg,濃度較低時,直接用乙腈提取,喹啉銅保留時間為6~8 min;A:乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取;B:直接用乙腈提取。

    2.3 ?流動相的優(yōu)化

    本研究考察了乙腈水、乙腈磷酸鹽緩沖液、乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液3個不同體系的流動相,色譜圖見圖4。乙腈水流動相體系中喹啉銅響應(yīng)很小,乙腈磷酸鹽緩沖液流動相體系中喹啉銅保留時間在2 min左右,無法與黃瓜基質(zhì)中的雜峰分開。

    乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液體系中分離效果好,響應(yīng)高,其主要原因是十二烷基硫酸鈉為離子對試劑,加入到流動相后與喹啉銅生成不帶電荷的中性離子,增加喹啉銅與固定相的作用,使分配系數(shù)增加,喹啉銅的保留時間由此前的2 min延長為7 min左右,從而達(dá)到更好的分離效果。但是十二烷基硫酸鈉對C18柱有一定程度的損傷,影響其使用壽命,濃度越高,損傷越大。本研究同時考察了pH為3時2.5、1.25、0.625?mmol/L 3個濃度的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相,以期得到喹啉銅峰形較好,十二烷基硫酸鈉濃度較低的流動相。結(jié)果表明,十二烷基硫酸鈉濃度為2.5 mmol/L時,流動相易產(chǎn)生乳白色沉淀,難以抽濾;濃度為0.625 mmol/L時,喹啉銅出峰較早,保留時間為4 min左右,受雜峰干擾;濃度為1.25 mmol/L時,喹啉銅峰形較好,響應(yīng)較高,周圍無雜峰干擾,因此選擇1.25?mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系。

    A:乙腈水;B:乙腈磷酸鹽緩沖液;C:乙腈0.625 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液;

    D:乙腈1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液。

    A: Acetonitrile and water; B: PBS-acetonitrile; C: PBS and SDS (0.625 mmol/L)-acetonitrile;

    D: PBS and SDS (1.25 mmol/L)-acetonitrile.

    2.4 ?凈化條件的選擇

    本研究比較了多壁碳納米管、C18和PSA填料凈化對回收率的影響,結(jié)果見圖5。多壁碳納米管具有較高比表面積和較強(qiáng)的物理吸附能力[15],有利于色素類和極性物質(zhì)的去除。多壁炭納米管不同用量下的回收率表明,多壁碳納米管用量超過10 mg時,回收率低于70.0%,達(dá)不到農(nóng)藥殘留分析要求。C18填料是一種硅膠基質(zhì)吸附劑,通過疏水作用吸附非極性和弱極性化合物。C18填料不同用量下的回收率表明:C18填料用量50 mg時回收率為100.4%,用量100 mg時回收率為97.0%,當(dāng)用量超過300 mg時,回收率低于70.0%,達(dá)不到農(nóng)藥殘留分析要求。PSA填料為乙二胺基-N-丙基硅烷,極性比C18填料強(qiáng),對中等極性的多種化合物具有較好的吸附能力。PSA填料不同用量下的回收率表明:PSA填料用量對回收率的影響不明顯,均在95.9%~102.2%之間。從凈化效果來說,多壁碳納米管用量超過10 mg,色素去除較為干凈,上機(jī)液澄清,C18和PSA填料用量增加,上機(jī)液顏色變化不大;從色譜圖來看,50 mg C18填料凈化后雜峰更少,因此選擇50?mg C18填料進(jìn)行凈化。

    A: 多壁碳納米管; ?B: C18和PSA

    A: Multi-walled carbon nanotubes; B: Octadecylsilane and primary-secondary amine absorbent

    3 ?討論

    本研究以分散固相萃取-高效液相色譜法進(jìn)行分析,快速、簡單、準(zhǔn)確度高,目前喹啉銅尚無檢測方法標(biāo)準(zhǔn),據(jù)文獻(xiàn)報道,喹啉銅分析方法現(xiàn)在主要有氣相色譜法[5-6]和高效液相色譜法,氣相色譜法需要將喹啉銅衍生化為8-羥基喹啉,前處理操作繁瑣,易引起目標(biāo)物的損耗。液相方法無需衍生,其方法準(zhǔn)確度更高,王志新等[5]用氣相色譜法檢測了蘋果中喹啉銅,其回收率在79.8%~98.3%之間,本方法回收率在92.3%~ 107.7%之間。同時我們對提取和凈化方法進(jìn)行了優(yōu)化,目前喹啉銅的提取方法有超聲、振蕩和勻漿,王志新等[5]用30 mL提取劑振蕩60 min提取,肖浩等[12]用80 mL提取劑超聲30 min提取,提取劑用量大,提取時間長,本研究以15 mL鹽酸乙腈溶液渦旋10 min提取,節(jié)省了提取劑用量和提取時間。本研究采用分散固相萃取法進(jìn)行凈化,相比現(xiàn)有的固相萃取法[7]和液液萃取法[10]凈化,前處理操

    作簡單,節(jié)省人力和時間。在色譜分離方面,肖浩、周夢春等人用高效液相色譜法[12-14]測定水稻、土壤、番茄和黃瓜中喹啉銅,均采用5 mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系,本方法采用1.25 mmol/L的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系,十二烷基硫酸鈉濃度低,分離效果好,并且對C18柱及色譜系統(tǒng)的損傷更小。通過回收率試驗證明,本方法精密度和準(zhǔn)確度高、檢出限低、結(jié)果重現(xiàn)性好,回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求,可用于大批量黃瓜樣品中喹啉銅殘留的分析檢測。

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