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    生物酶法水解海魚皮的研究

    2019-09-05 04:04:42呂夢嫻
    飼料工業(yè) 2019年16期
    關(guān)鍵詞:馬哈魚皮酶制劑

    ■程 瑛 王 冠 呂夢嫻 劉 營

    (武漢新華揚生物股份有限公司,湖北武漢430074)

    2017年漁業(yè)年鑒顯示:全國水產(chǎn)總量6 445.33萬噸,比上年增長1.03%;在國內(nèi)漁業(yè)生產(chǎn)中,海水養(yǎng)殖魚類產(chǎn)量為141.94萬噸,比上年增加12.70萬噸,淡水養(yǎng)殖魚類2 540.98 萬噸,比上年增長0.88 萬噸[1]。隨著魚類產(chǎn)量的不斷增長,我國魚類加工產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展,2017年魚類的加工量達(dá)2 196.25萬噸。魚類加工業(yè)的快速發(fā)展,產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物,其中主要包括魚皮,占魚總重量10%左右[2]。魚皮中蛋白含量高,是巨大的潛在可利用蛋白資源,可用來制備膠原蛋白、明膠等產(chǎn)品,而膠原蛋白在醫(yī)藥、化妝品、保健品等高附加值產(chǎn)品領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的利用,因此,如直接廢棄魚皮會造成嚴(yán)重的資源浪費。

    本實驗的目的是能夠合理的利用水產(chǎn)品下腳料,減少資源浪費,同時可以帶來一定的經(jīng)濟效益,開闊水產(chǎn)品下腳料的市場。我國是馬哈魚加工和代加工大國,加工過程中產(chǎn)生大量廢棄魚皮。因此,本實驗以海魚皮馬哈魚皮為實驗材料。馬哈魚是名貴冷水魚,其魚皮膠原蛋白或明膠與其他魚類相比有自身特點,更易被吸收利用,被認(rèn)為是開發(fā)膠原蛋白肽等功能產(chǎn)品的良好資源,具有廣闊的市場開發(fā)價值。國內(nèi)外利用魚皮提取明膠的研究很多,所用魚皮原料多為鯊魚魚皮[3]、草魚魚皮[4]和單角革鲀魚魚皮[5]等,但是對馬哈魚魚皮提取明膠或者其他功能型膠原蛋白的研究較少。且國內(nèi)未見馬哈魚魚皮加工利用的相關(guān)報道,國外對馬哈魚魚皮的加工利用研究也鮮有報道。

    國內(nèi)外很多的報道對魚皮的處理采用強酸堿的方法,此種處理方法不僅對環(huán)境污染大,并且操作復(fù)雜,耗時較長且危險,本實驗不采用傳統(tǒng)的酸堿處理方法,直接采用環(huán)保安全的酶解法來處理馬哈魚魚皮,得到目標(biāo)分子量的小肽,并且減少環(huán)境污染。根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,平均分子量≤500 Da 稱為小肽,平均分子量1 000~3 000 Da稱為多肽,平均分子量3 000~5 000 Da稱為大肽。本實驗希望通過酶解法能夠得到目標(biāo)分子量的肽,且比較幾種酶解法的可行性。

    1 材料與方法

    實驗用水應(yīng)符合GB/T 6682 中二級用水的規(guī)格,使用試劑除特殊規(guī)定外,均為分析純。

    1.1 試劑材料

    1.1.1 酶制劑

    堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶均來源于武漢新華揚生物股份有限公司。海魚皮為馬哈魚皮。

    1.1.2 試劑和儀器

    硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、濃鹽酸、無水碳酸鈉、溴甲酚綠-甲基紅指示劑、三氯乙酸(國藥集團),乙腈、三氟乙酸(色譜純),細(xì)胞色素C、抑酞酶、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(中國計量科學(xué)研究院)等試劑。

    THZ-82 恒溫水浴搖床(常州國華),凱氏定氮儀(Foss),高效液相色譜儀(安捷倫):配有紫外檢測器和含有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站或積分儀,凝膠色譜柱(賽分科技)。

    1.2 方法

    1.2.1 海魚皮的酶解反應(yīng)

    按照馬哈魚皮與水的質(zhì)量比1∶4的比例配制魚皮水混合液,其中水的pH值提前使用10%的碳酸鈉調(diào)節(jié)至8.0~9.0,記錄反應(yīng)器和魚皮水混合液的總重,在50 ℃恒溫水浴搖床中預(yù)熱5~10 min,按照各添加量加酶制劑,攪拌均勻,繼續(xù)于50 ℃恒溫水浴搖床中酶解2 h,酶解完成之后,沸水浴滅酶10 min,冷卻,定重,檢測各項指標(biāo)。

    1.2.2 水解度

    凱氏定氮法測定。

    1.2.3 酸溶蛋白

    TCA法測定。

    1.2.4 肽分子量檢測

    色譜柱:SRT SEC-150 7.8×300 mm(內(nèi)徑)或性能與此相近的同類型其他適用于測定蛋白質(zhì)和肽的凝膠柱。流動相:乙腈+水+三氟乙酸=19.98+79.92+0.1。檢測波長:220 nm。流速:0.5 ml/min。檢測時間:33 min。進(jìn)樣體積:20 μl。柱溫:25 ℃。

    相對分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:分別用流動相配制成質(zhì)量濃度為1 mg/ml的上述不同相對分子質(zhì)量肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按一定比例混合后,用孔徑0.2~0.5 μm 有機相膜過濾后進(jìn)樣,得到標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)對保留時間作圖或作線性回歸得到相對分子質(zhì)量校正曲線及其方程。

    1.2.5 不同的酶制劑

    a 組:堿性蛋白酶:添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.30%、0.40%、0.50%、0.60%;

    b 組:中性蛋白酶:添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.36%、0.48%、0.60%;

    c 組:木瓜蛋白酶:添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.23%、0.30%、0.46%;

    d組:木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3:添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.50%、0.60%、0.70%、0.80%。

    以上四組實驗的添加量設(shè)計原則為保持四種配方的成本一致。按照上述四組實驗配制實驗用酶制劑,對馬哈魚皮進(jìn)行酶解實驗,比較常見指標(biāo)水解度、酸溶蛋白、肽分子量≤1 500 Da 的分布。實驗設(shè)計組如表1。

    2 結(jié)果

    2.1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解效果

    馬哈魚皮通過不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后的各項指標(biāo)見表2,從表2中可看出,添加量逐漸加大,其水解度和酸溶蛋白的變化小,無法比較出哪個添加量的酶解效果好,從肽分子量≤1 500 Da分布可看出,堿性蛋白酶的添加量為0.3%時最差,添加量逐漸增大,目標(biāo)肽分布面積逐漸變大,但趨勢并不明顯,因此,可以根據(jù)對分子量的需求來確定堿性蛋白酶的添加量。

    表1 實驗設(shè)計組

    表2 不同添加量的堿性蛋白酶的酶解結(jié)果

    圖1 中標(biāo)準(zhǔn)品,從10 min 開始出現(xiàn)四個明顯的峰,依次為細(xì)胞色素C(分子量為12 500 Da)、抑酞酶(分子量為6 500 Da)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(簡稱四肽,分子量為451 Da)和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(簡稱三肽,分子量為189 Da);添加量為0.3%的堿性蛋白酶,在10 min 之前出現(xiàn)一個峰,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品信息可斷定此峰的化合物分子量在12 500 Da 以上,說明此添加量下,存在未被酶解的化合物,因此需加大堿性蛋白酶的添加量。比較另外三個添加量,從色譜圖可看出,在15~25 min之間,三組添加量的肽分子分布基本重合,差異表現(xiàn)在峰面積有所不同,添加量越大,峰面積越大,但是遞增趨勢并不明顯。

    圖1 不同添加量的堿性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

    從表2 和圖1 可看出,隨著堿性蛋白酶添加量的改變,有明顯變化的是添加量從0.3%到0.4%,分子量≤500 Da的肽分布面積增大,從0.4%開始的添加量各指標(biāo)顯示分子量1 500 Da 以上的肽的分布變化差異不明顯。四組添加量中水解度、酸溶蛋白這兩項指標(biāo)并無明顯差異。

    2.2 不同添加量的中性蛋白酶酶解效果

    馬哈魚皮通過不同添加量中性蛋白酶酶解之后的各指標(biāo)見表3,從表3 可看出,添加量逐漸增大,其水解度和酸溶蛋白的變化差異小,而酶解之后肽分子量≤1 500 Da的分布比例增大。

    圖2中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從色譜圖中可看出,三種添加量的中性蛋白酶出現(xiàn)的峰基本重疊,差異在于峰高不同,依次為0.60%的中性蛋白酶>0.48%的中性蛋白酶>0.36%的中性蛋白酶,因此,從色譜圖來看,添加量越高,出現(xiàn)重疊部分的峰面積越大,說明添加量增大,各目標(biāo)肽的含量在增加。

    從表3 和圖2 可以看出,目標(biāo)肽的分布面積在緩慢增大,但并不明顯,當(dāng)中性蛋白酶的添加量到0.60%,分子量≤5 000 Da的肽的分布面積達(dá)到90%左右,說明中性蛋白酶添加量到一定的量時,完全可以都酶解為分子量為5 000 Da的肽。

    表3 不同添加量的中性蛋白酶的酶解結(jié)果

    圖2 不同添加量的中性蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

    2.3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解效果

    馬哈魚皮通過不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后的各項指標(biāo)見表4,從表4 中的各指標(biāo)可以看出,隨著添加量的增大,酸溶蛋白幾乎無變化,水解度先增加后降低,而肽分子量基本上都在1 000 Da以下,說明木瓜蛋白酶的效果很好,如果目標(biāo)肽分子量需求是1 000 Da 以下,可以選取合適添加量的木瓜蛋白酶。

    表4 不同添加量的木瓜蛋白酶的酶解結(jié)果

    表4中木瓜蛋白酶的添加量在增加,分子量300 Da以下的有差異,有下降的趨勢,而分子量1 000 Da 以下的差異不明顯。

    圖3中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從色譜圖上可看出,三種添加量的木瓜蛋白酶出現(xiàn)的峰基本重疊,最高峰值的保留時間離四肽較近,并且三組不同的添加量下,僅出現(xiàn)一組比較明顯的峰,可見,經(jīng)過木瓜蛋白酶酶解之后的肽基本集中在一起,并且三種不同的添加量的木瓜蛋白酶的出峰的峰高也基本重合,說明木瓜蛋白酶的添加量可以更少。

    從表4 和圖3 可以看出,木瓜蛋白酶的作用效果很明顯,酶解之后的肽分子量大多≤1 000 Da,根據(jù)下游產(chǎn)品的需求,如果希望魚皮酶解之后多為≤1 000 Da,可選擇采用木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解。

    圖3 不同添加量的木瓜蛋白酶酶解之后高效液相色譜圖

    2.4 不同添加量的復(fù)合酶制劑(木瓜蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶3)酶解效果

    馬哈魚皮通過不同添加量的復(fù)合酶制劑酶解之后的各項指標(biāo)見表5,從表5中各指標(biāo)可以看出,復(fù)合酶制劑添加量為0.8%時,水解度最高,酸溶蛋白最高,但是分子量≤1 000 Da的肽分布面積反而降低,而添加量為0.7%的分子量≤1 000 Da的肽分布比例最高;其次,復(fù)合酶制劑添加量增加,分子量≤300 Da的肽分布比例增加,當(dāng)添加量到0.80%時,出現(xiàn)下降趨勢,說明復(fù)合酶的使用不能提高小肽含量,可以明顯提高多肽的含量。

    表5 不同添加量的復(fù)合酶制劑的酶解結(jié)果

    圖4中標(biāo)準(zhǔn)品分析同圖1分析。從圖4上可以看出,除了添加量為0.80%復(fù)合酶制劑的峰高比較高,其他三條基本重合,說明0.5%、0.6%、0.7%三個梯度,隨添加量增加,并不明顯增加≤3 000 Da肽的含量。

    3 討論

    3.1 不同添加量的堿性蛋白酶和中性蛋白酶對馬哈魚皮的酶解

    堿性蛋白酶和中性蛋白酶均是一種內(nèi)切酶,多屬于絲氨酸蛋白酶,絲氨酸蛋白酶催化底物蛋白質(zhì)水解時通常有兩個步驟:在水解過程中,隨著氨基酸的丟失和肽鏈的斷裂還形成共價酶-肽復(fù)合的中間二聚體;然后脫去酰基,通過水對中間體的親核攻擊,從而使底物肽鍵水解。堿性蛋白酶的酶切位點主要斷裂疏水氨基酸的C 末端,可特異性切割谷氨酰胺-組氨酸、絲氨酸-組氨酸、亮氨酸-酪氨酸、酪氨酸-蘇氨酸之間的肽鍵[6]。而中性蛋白酶對酶切位點無特異性。兩種酶的作用效果來看,中性蛋白酶的水解度稍差。從分子量的分布情況來看,兩者的小肽含量分布面積較高,肽分子量≤5 000 Da 的分布情況在成本一致的情況下,隨著添加量的增大基本趨于一致。由于酶解馬哈魚皮之后需制作的產(chǎn)品的要求各不相同,因此,可以根據(jù)產(chǎn)品需求選擇相應(yīng)的配方。

    3.2 不同添加量的木瓜蛋白酶對馬哈魚皮的酶解

    木瓜蛋白酶是一種內(nèi)切酶,屬于巰基蛋白酶,可水解絕大多數(shù)肽鍵,但對不同肽鍵水解的速率相差較大,該酶對蛋白質(zhì)或多肽中精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽鍵非常敏感[7-10]。它的作用機制為:在His-159作用下Cys-25去質(zhì)子化,而Asn-158能夠幫助His-159的咪唑環(huán)的擺放,使得去質(zhì)子化可以發(fā)生,然后Cys-25親核攻擊主鏈上的羧基端,并與之共價鏈接形成酰基-酶中間體,接著酶與一個水分子作用,發(fā)生去?;?,并釋放肽鏈的羧基末端,他的酶切位點具有廣泛特異性,主要包括Arg-、Lys-、Phe-X-。木瓜蛋白酶屬于動物性水解蛋白酶,從酶解之后的水解度來看,添加量變大,水解度出現(xiàn)下降趨勢,但是小肽含量的分布情況變化不大,集中在300~1 000 Da,如果產(chǎn)品對小肽要求含量比較高,木瓜蛋白酶是個很好的選擇。

    圖4 不同添加量的復(fù)合酶制劑酶解之后高效液相色譜圖

    3.3 不同添加量的復(fù)合酶制劑對馬哈魚皮的酶解

    復(fù)合酶制劑包括木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶,這兩種酶均屬于內(nèi)切酶,但是兩種酶均有各自專屬的肽鍵切割位點,其水解活力均較高,因此可將這兩種酶組合使用。組合使用之后水解度均達(dá)到80%以上,小肽含量隨著添加量的增加先增大后減小,分子量3 000 Da以下肽的變化差異小??筛鶕?jù)產(chǎn)品需求選擇合適的添加量配方。

    4 結(jié)論

    ①本實驗選取的四組酶制劑配方,其水解度都達(dá)到80%以上,堿性蛋白酶效果更佳;酸溶蛋白的含量均在2.0%左右,差異不明顯。

    ②從整體的分子量分布來看,木瓜蛋白酶的效果最好,酶解之后基本都是小肽,其次是堿性蛋白酶,其次是中性蛋白酶,復(fù)合酶制劑效果最差。

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