MSM人群早期梅毒合并HIV感染NK和DC細(xì)胞數(shù)目的研究

汪曉丹,張 明,李 娟,翁文佳,高艷青

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院皮膚科,北京 100069;*通訊作者,E-mail:gyqing2001bj@sina.com)

20世紀(jì)以來(lái)隨著HIV/AIDS的流行及其他危險(xiǎn)因素的增多,如靜脈吸毒、男男性接觸(men who have sex with men,MSM),梅毒合并HIV的感染率越來(lái)越高。以色列一項(xiàng)研究[1]發(fā)現(xiàn)雖然抗病毒治療已推廣,但HIV在MSM者的感染率仍在攀升,相應(yīng)的梅毒在MSM HIV感染者中的患病率也在升高。梅毒與HIV感染的免疫反應(yīng)均較復(fù)雜,本研究嘗試從固有免疫細(xì)胞NK、DC著手,初步探索梅毒合并HIV感染的相互作用,為HIV合并梅毒患者的臨床診斷、治療提供進(jìn)一步理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象均來(lái)自2009-2014年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院性病艾滋病診療中心隨訪的MSM隊(duì)列人群。其中26例早期梅毒患者(包括一期、二期梅毒、早期潛伏梅毒,且不伴HIV感染),18例HIV感染者(外周血CD4≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月),18例早期梅毒合并HIV患者(外周血CD4≥350個(gè)/μl,感染HIV時(shí)間>6個(gè)月)。收集病例過(guò)程中不包括年齡小于18歲、孕婦或合并有活動(dòng)性肺結(jié)核的患者。所有梅毒患者均未進(jìn)行驅(qū)梅治療,所有HIV感染者均未進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretro-viral therapy,HAART)治療。選擇MSM隊(duì)列中性別和年齡相匹配的未暴露于HIV和梅毒的20例健康者作為對(duì)照。四組入選得一般情況見(jiàn)表1。

表1 四組患者的基線資料

組別病例數(shù)年齡(歲)梅毒分期(例)基線RPR一期梅毒二期梅毒早期潛伏梅毒≤1∶41∶8-1∶32>1∶32CD4計(jì)數(shù)(個(gè)/μl)HIV載量(copies/ml)健康組2036(24-53)--------早期梅毒組2631(24-42)481411132--HIV組1829(19-44)------436(359-530)30920(1294-1157417)合并組1833(20-48)35103132410(351-623)45621(460-266000)

表中的數(shù)據(jù)為中位數(shù)(范圍),“-”為未做

1.2 方法

1.2.1 Ficoll-Hypaque密度離心法分離PBMC 健康對(duì)照組采集新鮮血。取新鮮采集的EDTA抗凝全血離心(TGL-16G臺(tái)式離心機(jī),北京六一儀器廠)去除血漿后,用PBS稀釋一倍,加至淋巴細(xì)胞分離液上層,2 500 r/min,離心25 min,取中間白膜層(即單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞富集層),PBS洗滌2遍,得到外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組均為凍存PBMC,于42 ℃恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司),快速晃動(dòng)凍存管,使凍存的細(xì)胞在1 min內(nèi)解凍。

1.2.2 熒光抗體染色 利用熒光抗體染色,MutilTestCD 3FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC(美國(guó)BD公司),CD3 PerCP,CD4 APC,CD123 PE,CD11C APC(美國(guó)eBioscience公司)。選擇CD3-CD16+CD56+來(lái)界定NK細(xì)胞,利用CD123 PE標(biāo)記pDC,利用CD11c APC標(biāo)記mDC。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 采用FACSCalibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司),分析早期梅毒組、HIV感染組、早期梅毒合并HIV感染組及健康組外周血中NK細(xì)胞、DC細(xì)胞數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 四組間NK細(xì)胞的比較

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中NK細(xì)胞，結(jié)果表明,合并組的NK細(xì)胞比率(13.82%±3.36%)比健康對(duì)照組(34.30%±4.25%)明顯降低(P<0.05),其余各組間比率均無(wú)明顯差異(見(jiàn)圖1)。

與健康組比較，*P<0.05圖1 NK細(xì)胞在四組人群中的比較 (*P<0.05)

2.2 四組間DC細(xì)胞的比較

分析HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人外周血中DC兩個(gè)亞群mDC和pDC所占比率的差異，結(jié)果顯示，HIV感染組mDC比率(3.50%±0.47%)明顯低于早期梅毒組(12.47%±1.53%,P<0.001)、合并組(7.79%±0.48%,P<0.05)、健康組(5.36%±0.57%,P<0.05);早期梅毒組明顯高于健康組(P<0.05),其余組間比率均無(wú)明顯差異。pDC在四組間未發(fā)現(xiàn)差異(見(jiàn)圖2)。

與健康組比較，*P<0.05;與HIV組比較，#P<0.05,##P<0.001圖2 mDC和pDC在四組人群中的比較

3 討論

因?yàn)閭鞑ネ緩较嗨?梅毒和HIV感染相互促進(jìn)。梅毒下疳或其他皮損局部的樹(shù)突狀細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞有利于HIV全身播散[2]。此外,梅毒感染可使外周血HIV病毒載量升高,CD4數(shù)目下降,從而增加HIV傳播給其他性伴侶的概率[3]。梅毒免疫反應(yīng)極其復(fù)雜,病理生理研究表明,梅毒不僅僅是由于毒性或炎癥物質(zhì)釋放造成的簡(jiǎn)單急性炎癥反應(yīng),梅毒皮損中占主導(dǎo)地位的是單核巨噬細(xì)胞,而非急性炎癥的多核白細(xì)胞。目前認(rèn)為梅毒的免疫是一種遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),它的效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子在梅毒螺旋體的清除過(guò)程中起重要作用。然而,HIV作為一種免疫缺陷病毒,可引起細(xì)胞免疫嚴(yán)重受損,人們推測(cè)HIV感染或許可以改變機(jī)體針對(duì)梅毒螺旋體的感染免疫。研究發(fā)現(xiàn)在21.8%有梅毒癥狀的HIV梅毒共感染患者中觀察到皮膚外非典型臨床表現(xiàn),包括眼部、胃腸道等癥狀[4]。推測(cè)處于免疫缺陷狀態(tài)時(shí),梅毒可能會(huì)加速進(jìn)展,甚至出現(xiàn)所謂的“惡性梅毒”[5]固有免疫作為機(jī)體免疫的第一道防線,在疾病的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中起重要作用,我們分別檢測(cè)了HIV感染者、早期梅毒患者、早期梅毒合并HIV感染者及健康人的NK、DC細(xì)胞,以此初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點(diǎn)。

3.1 NK細(xì)胞與梅毒

NK細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的第一道防線,在適應(yīng)性免疫啟動(dòng)之前,就可發(fā)揮免疫效應(yīng)。它可分泌細(xì)胞因子INF-γ、TNF-β等,通過(guò)NK-INF-γ-巨噬-IL-12這一固有免疫網(wǎng)絡(luò),維持Th1在梅毒感染中的優(yōu)勢(shì)狀態(tài)[6]。NK細(xì)胞作用機(jī)制主要是通過(guò)激活凋亡酶系統(tǒng)以及表達(dá)抑制性受體來(lái)平衡其在機(jī)體中的免疫作用[7]。目前關(guān)于NK在梅毒患者的研究主要集中在功能和外周血的數(shù)量。多數(shù)研究認(rèn)為梅毒患者NK細(xì)胞功能下降,即抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)及INF-γ、TNF-α分泌能力下降,且這種下降與梅毒病程遷延有關(guān)。但Jensen等[8]對(duì)25例早期梅毒患者,包括一期、二期和隱性梅毒患者治療前后分析發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞活性與梅毒分期有關(guān):一期梅毒血清轉(zhuǎn)陽(yáng)之前NK細(xì)胞功能升高,而在二期或隱性梅毒血清轉(zhuǎn)陽(yáng)之后,NK細(xì)胞活性下降。并發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞活性下降與血清中的循環(huán)免疫復(fù)合物相關(guān),通過(guò)阻滯與Fc受體的結(jié)合,減弱了NK細(xì)胞的ADCC作用。關(guān)于NK細(xì)胞在外周血的數(shù)量,國(guó)內(nèi)外研究研究較少,目前無(wú)較為一致的觀點(diǎn)。Cruz等[9]第一次發(fā)現(xiàn)梅毒患者外周血NK細(xì)胞總量下降,但無(wú)功能的CD56negativeCD16brightNK細(xì)胞卻升高。CD56negativeCD16brightNK細(xì)胞ADCC活性及INF-α、TNF-α分泌能力均較差,一般多在難以控制的病毒感染中升高。

3.2 NK細(xì)胞與HIV感染

在HIV感染中,關(guān)于NK細(xì)胞較為一致的結(jié)論為:NK細(xì)胞的功能如ADCC,細(xì)胞因子分泌下降,無(wú)功能性的NK細(xì)胞亞群即CD56negativeCD16brightNK異常升高,NK細(xì)胞的總量變化不大。Madhavi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HIV感染慢性期ADCC活性低的CD56negativeCD16brightNK細(xì)胞異常增多,并在抗病毒治療后恢復(fù)。推測(cè)這部分無(wú)功能性NK細(xì)胞可能與CD4恢復(fù)不良及免疫重建不良有關(guān)[11]。有研究認(rèn)為NK細(xì)胞在組織的重新分布造成了其外周血數(shù)目的減少[12]。

本研究對(duì)早期梅毒組、HIV感染組、梅毒合并HIV感染組與健康對(duì)照組進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)合并組NK細(xì)胞明顯低于健康對(duì)照。而HIV感染組、早期梅毒組NK細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)明顯減少。或許是由于合并HIV感染后,大量出現(xiàn)無(wú)功能的NK細(xì)胞亞群即CD56negativeCD16brightNK,所以外周血CD16+CD56+NK相應(yīng)減少。

3.3 DC細(xì)胞與梅毒

DC是功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞,是聯(lián)接固有免疫與適應(yīng)性免疫的“紐帶”,在梅毒感染中,DC另一個(gè)重要的作用是免疫調(diào)節(jié)功能。它的兩個(gè)亞群mDC和pDC可對(duì)不同抗原表達(dá)產(chǎn)生不同的細(xì)胞因子,mDC通過(guò)合成和分泌IL-12促進(jìn)Th細(xì)胞向Th1分化;pDC不分泌IL-12,可使Th細(xì)胞向Th2分化。在梅毒“Th1向Th2漂移”現(xiàn)象中起調(diào)節(jié)作用。對(duì)四組樣本的比較發(fā)現(xiàn):早期梅毒患者外周血CD11c+mDC細(xì)胞高于正常人,而CD123+pDC細(xì)胞與正常人無(wú)顯著差異。提示梅毒螺旋體在機(jī)體內(nèi)促使DC向mDC分化,Th1反應(yīng)增強(qiáng),引起細(xì)胞免疫;而pDC無(wú)明顯增多,Th2型反應(yīng)未見(jiàn)明顯增強(qiáng),提示體液免疫在梅毒病程中的作用較弱。

3.4 DC細(xì)胞與HIV

DC在發(fā)揮早期免疫作用的同時(shí),也是HIV感染的靶細(xì)胞和儲(chǔ)存場(chǎng)所。HIV感染后外周血和組織中的DC數(shù)量往往大幅減少,功能下降。CD123+的pDC為DC主要亞群,能分泌INF-γ,抑制HIV病毒復(fù)制,增強(qiáng)T細(xì)胞、單核細(xì)胞的功能,是固有免疫抗HIV感染的重要組成部分。DC在抑制與清除HIV的同時(shí),也可能促進(jìn)HIV病毒在體內(nèi)播散。DC細(xì)胞表面有CCR4、CCR5、CXCR4等受體,這些都是HIV侵入細(xì)胞的輔助受體。因此,DCs在HIV感染中的作用始終存在爭(zhēng)議。有學(xué)者對(duì)長(zhǎng)期無(wú)進(jìn)展者(long term nonprogressors,LTNPs)、正常進(jìn)展的HIV感染者以及AIDS患者進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)LTNPs者pDC顯著升高,而AIDS顯著降低,且外周血的pDC數(shù)目與HIV病毒載量呈負(fù)相關(guān),pDC數(shù)目減少與機(jī)會(huì)性感染有關(guān)[13,14]。但亦有學(xué)者報(bào)道HIV感染后DC的數(shù)量和功能未發(fā)生改變[15,16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)60周抗病毒治療(ART)后,典型慢性HIV感染者的mDC始終低于長(zhǎng)期無(wú)進(jìn)展者,推測(cè)mDC或可保護(hù)HIV感染者免于進(jìn)展至AIDS。為了更好地描述其免疫狀態(tài),本研究選取CD4≥350個(gè)/μl,感染時(shí)間>6個(gè)月的典型慢性HIV感染者,結(jié)果發(fā)現(xiàn),HIV感染患者中mDC與其他三組相比均降低,而pDC無(wú)明顯變化，與Zhang等[17]研究結(jié)果一致。合并組mDC高于HIV感染組,或許與HIV患者感染早期梅毒后機(jī)體Th1反應(yīng)增強(qiáng),mDC相應(yīng)升高,“中和”HIV感染對(duì)mDC的消耗有關(guān)。梅毒和HIV感染均以細(xì)胞免疫為主,故pDC介導(dǎo)的體液免疫在以上不同患者組間未發(fā)現(xiàn)差異。

本研究從固有免疫NK、DC細(xì)胞著手初步探索梅毒合并HIV感染相互作用的特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)梅毒合并HIV感染者在一定程度上增加了機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的損耗,促進(jìn)了梅毒的進(jìn)展。但梅毒與HIV感染的免疫反應(yīng)極為復(fù)雜,固有免疫僅為人體免疫的第一道防線,未來(lái)仍需要更多的研究來(lái)探索適應(yīng)性免疫,以徹底闡明梅毒合并HIV感染的免疫狀態(tài)。