硫酸脫氫表雄酮抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的分子機(jī)制研究

瞿茹怡,徐玉梅,蔣 英,鄭 潔*

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院分子診斷科,上海 200011;2上海市第四人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科;*通訊作者,E-mail:zjshiyifenyuan@163.com)

脂肪組織不僅是能量儲存器官,也是體內(nèi)最大的內(nèi)分泌腺,通過分泌一系列脂肪因子,如瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、抵抗素(resistin)和網(wǎng)膜素(omentin)等參與多種體內(nèi)病理生理過程,如能量平衡、食欲調(diào)節(jié)、胰島素敏感性的調(diào)節(jié)、局部類固醇激素的代謝等,調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、代謝與生殖等眾多生理過程。能量過剩導(dǎo)致體脂增加和分布異常(主要是腹型肥胖),脂肪源性的炎癥因子分泌增加,是體內(nèi)代謝性炎癥發(fā)生發(fā)展的重要組成部分。與之直接相關(guān)的胰島素抵抗增加,成為糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化型心臟病、高血壓、脂肪肝和女性多囊卵巢綜合征等代謝紊亂相關(guān)性疾病的主要高危因素。

脫氫表雄酮(DHEA)及其硫酸鹽(DHEA-S)是人體循環(huán)中最豐富的類固醇激素。臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)它有多種生理功能,如調(diào)節(jié)免疫、增加胰島素敏感性、抗動脈粥樣硬化、增加老年人的認(rèn)知能力、減輕肥胖患者體重和改善老年人骨質(zhì)疏松等[1,2]。此外,補(bǔ)充DHEA-S還有助于改善動脈粥樣硬化、女性不育和衰老相關(guān)的認(rèn)知能力下降[3,4]。對脂肪的研究發(fā)現(xiàn),25-75 μmol/L DHEA抑制大鼠和豬原代前脂肪細(xì)胞的分化和增殖,抑制C/EBP-α的表達(dá)[5]。Kajita等[6]發(fā)現(xiàn)DHEA顯著抑制OLTF大鼠脂肪PPARγ和C/EBPα的表達(dá)。在對人源性的原代脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn),DHEA抑制人SVF細(xì)胞的增殖,但增加人前脂肪細(xì)胞的分化[7];McNelis等[8]發(fā)現(xiàn)DHEA顯著抑制人皮下脂肪細(xì)胞株Chub-S7的增殖、分化和11HSDB1的表達(dá)。Rice等[9]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),DHEA除了抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖,還抑制人網(wǎng)膜脂肪細(xì)胞的脂質(zhì)形成。相對于DHEA,DHEA-S對脂肪細(xì)胞的分化研究較少。本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞株作為研究對象,觀察DHEA-S對3T3-L1細(xì)胞分化的影響,并觀察調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵基因:過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1 c,SREBP1-c)即脂肪細(xì)胞定向分化因子1(adipocyte determination and differentiation-dependent factor 1,ADD1)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α、β、δ(CCAAT-enhancer-binding proteins α、β、δ,C/EBP-α、β、δ)、11β-羥類固醇脫氫酶1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1,11HSDB1)、激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)、脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)mRNA表達(dá)的變化。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DHEA-S購于美國International Labotory公司(IL,USA);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素、0.25%胰蛋白酶購于Gibco(Grand Island,USA);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real time-PCR試劑盒(TaKaRa,Japan);TRIzol試劑(Invitrogen, USA)。G3PDH檢測試劑盒購于逸峰生物。常規(guī)型胰島素(Lily,USA)。二甲基亞砜(DMSO)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松和油紅“O”均購于美國SIGMA公司。引物合成由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化

3T3-L1前脂肪細(xì)胞由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院劉偉課題組惠贈。3T3-L1前脂肪細(xì)胞以5×105/ml的密度接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁生長,根據(jù)細(xì)胞生長情況,每2 d換液1次,待細(xì)胞長滿80%-90%皿底,用0.15%的胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng)。3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo):細(xì)胞長滿培養(yǎng)皿底部至細(xì)胞融合2 d,去除普通培液,換用細(xì)胞誘導(dǎo)液(IBMX+地塞米松+胰島素)誘導(dǎo)分化48 h。此后,換用普通培液,隔天更換培養(yǎng)液。

1.3 real time-PCR檢測3T3-L1細(xì)胞mRNA的表達(dá)

分別于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后第1,2,4,6,10,14天收集細(xì)胞,總RNA提取采用Trizol法,參考Trizol說明書操作提取總RNA。紫外分光光度儀測定OD260 nm/OD280 nm比值和總RNA濃度,取1 μg總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(20 μl體系),-20 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄條件為:37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃維持。以β-actin為內(nèi)參,用real time-PCR法觀察目的基因:PPARγ、ADD1/SREBP1-c、C/EBP-α、C/EBP-β、C/EBP-δ、11HSDB1、LPL和HSL mRNA表達(dá)的變化。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

Table 1 Sequences of primer for real time-PCR

基因 上游引物(5′-3′) 下游引物(5′-3′) β-actinGGGTCACTGGCGAGACAATGGCTAATAAGTCAAGACACCAGPPARγGGAGAAGTTACTGCGGTGTATAGATAAGCTGGGACCAGCCSREBP1cGCACCTGAAGCTGGACAACTCCTCGATCACAAGGTGAATGC/EBPαCCGAGAATGGGAAGCTTGTCAAGCACCAACGAGAGGAGAAC/EBPβCCTTTAGACCCATGGAAGTGGGAGAGGAAGTCGTGGTGCC/EBPδCACGACTCCTGCCATGTACGCCGGCCGCTTTGTGGTT11HSDB1ACTGGGGCCAGCAAAGGGAAGTCCGCCCATGAGCTTTCCHSLTGCTGCAGGAATCTGGTACCGGAGATGGCTTCCTGTTGATLPLAGCTGAGGACACTTGTCATCCGATACAACCAGTCTACTACA

1.4 前脂肪細(xì)胞分化和分化率的測定

用油紅“O”染色,鑒定成熟脂肪細(xì)胞:將誘導(dǎo)后第8-10天的3T3-L1細(xì)胞從培箱中取出,用4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液洗3次。10%甲醛溶液固定細(xì)胞15 min,PBS洗3次,將細(xì)胞放于通風(fēng)處晾干,加入事先配好的油紅“O”工作液,染色30 min,用60%異丙醇溶液洗2次,去除多余染料后用雙蒸水洗去殘余異丙醇,鏡下觀察并拍照。在200倍顯微鏡視野下計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和成熟脂肪細(xì)胞數(shù)(內(nèi)含脂滴,染成紅色)。前脂肪細(xì)胞分化率計(jì)算公式為:成熟脂肪細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。G3PDH活性檢測均按試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 獲取DHEA-S的最佳干預(yù)濃度

用100 mmol/L的DHEAS儲存液(含10%FBS培養(yǎng)液),用培養(yǎng)液稀釋為300 μmol/L的工作液。再用培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋:0.41,1.23,3.7,11.1,33.3,100,300 μmol/L。常規(guī)誘導(dǎo)后用上述濃度梯度的DHEAS干預(yù)。CCK-8檢測24 h、48 h和72 h細(xì)胞活力的變化(見圖1)。結(jié)合這一實(shí)際結(jié)果,在DHEA-S濃度超過50 μmol/L(細(xì)胞活力<30%)時(shí),細(xì)胞活力開始下降,100 μmol/L時(shí)3T3-L1細(xì)胞的死亡率近80%。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇DHEA-S的刺激濃度為50 μmol/L。

圖1 不同藥物濃度對細(xì)胞死亡率的影響Figure 1 Effect of different concentrations of DHEAS on cell death rate

2.2 油紅O染色觀察誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)3T3-L1脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積的變化

對照組前體脂肪細(xì)胞在分化培養(yǎng)基中逐漸分化為成熟的脂肪細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有脂質(zhì)滴聚集,被油紅O特異性染成紅色。兩組間比較可見,DHEA-S干預(yù)組油紅染色后比對照組顯著減少(見圖2)。

2.3 脂肪細(xì)胞分化率的比較

誘導(dǎo)后隨著時(shí)間點(diǎn)的延長,脂肪分化率呈明顯上升趨勢,DHEA-S組的細(xì)胞脂肪分化率均低于同期對照組(P<0.01,見圖3),表明DHEA-S抑制脂肪分化。

2.4 細(xì)胞的G3PDH活性檢測

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)為脂肪細(xì)胞特異表達(dá)的酶類,誘導(dǎo)分化前無活性,誘導(dǎo)后活性增加。誘導(dǎo)后第4天G3PDH活性增加,第10天活性進(jìn)一步增加。DHEA-S組的G3PDH活性比對照組的活性低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,見圖4)。

圖2 不同誘導(dǎo)階段兩組的油紅染色對比Figure 2 Comparison of oil red staining between two groups at different induction stages

與對照組比較，**P<0.01圖3 不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞脂肪分化率的比較Figure 3 Comparison of adipocyte differentiation rates between the two groups at different induction days

與對照組比較,**P<0.01圖4 不同時(shí)間點(diǎn)兩組細(xì)胞G3PDH活性的比較Figure 4 Comparison of G3PDH activities between two groups at different induction days

2.5 目的基因在不同分化時(shí)間點(diǎn)的水平變化

與誘導(dǎo)分化前(d0)相比,對照組的C/EBP-α的表達(dá)誘導(dǎo)后顯著增加,而DHEA-S全程顯著抑制C/EBP-α的表達(dá)(見圖5)。對照組C/EBP-β和C/EBP-δ誘導(dǎo)后第1,2天即顯著升高,而后逐漸下降;DHEA-S處理后,C/EBP-β和C/EBP-δ的表達(dá)與對照組相比,均顯著下降;其中DHEA-S也全程抑制C/EBP-β的表達(dá)(見圖5);而C/EBP-δ在DHEA-S作用下,誘導(dǎo)后1-6 d間的表達(dá)顯著低于對照組,至第10和14天,組間差異消失(見圖5)?？梢?同為一個(gè)家族的脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,DHEA-S對C/EBP-α的抑制最為顯著。DHEAS對ADD1/SREBP-1c的作用與C/EBP-β相近,但第10,14天時(shí)仍有抑制作用,組間差異具有顯著性(見圖5)。DHEA-S對誘導(dǎo)后LPL、HSL和PPARγ表達(dá)的抑制作用和C/EBP-α的變化一致(見圖5)。對照組HSL誘導(dǎo)后,第4天表達(dá)增加達(dá)顯著性,第6天后表達(dá)進(jìn)一步明顯上調(diào);而DHEA-S組第10天雖然較前有上調(diào),但仍顯著低于對照組(見圖5)。

與CON組比較,*P<0.05圖5 兩組間基因表達(dá)水平的變化Figure 5 Gene relative expression levels between two groups after induction

3 討論

DHEA-S是人體內(nèi)含量最豐富的類固醇激素,循環(huán)濃度達(dá)μmol級(1-10 μmol/L),而DHEA和大多類固醇激素一樣,為pmol至nmol級(2-30 nmol/L)[10]。人體分泌的DHEA很快由硫酸轉(zhuǎn)移酶2A1(sulfotransferase 2A1,SULT2A1)生成DHEAS存儲于體內(nèi)。在表達(dá)類固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS)的組織中,重新生成DHEA,再經(jīng)3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSDs)的催化下生成雄激素。因此,DHEA-S多被認(rèn)為是DHEA的儲存形式或性激素合成的前體,而忽視了其本身的生理作用。研究發(fā)現(xiàn)DHEA-S可以調(diào)節(jié)體脂分布,改善胰島素敏感性、降低骨質(zhì)疏松和心血管風(fēng)險(xiǎn)等[11-13]。

體脂含量和脂肪分布與脂肪細(xì)胞的分化、增殖密切相關(guān)。脂肪細(xì)胞的分化大致經(jīng)歷以下幾個(gè)階段:①中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的定向分化,形成一種無脂滴沉積的梭形成脂肪干細(xì)胞;②成脂肪細(xì)胞經(jīng)過生長抑制、克隆增殖,形成前脂肪細(xì)胞,并開始出現(xiàn)脂滴形成;③隨著脂質(zhì)在細(xì)胞中的沉積增加,逐步形成一個(gè)充滿脂滴的成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞分化的不同時(shí)期有不同的分子標(biāo)志,如LPL為早期的分子標(biāo)志,HSL為晚期分化標(biāo)志。此外脂肪細(xì)胞的分化成熟過程受一系列轉(zhuǎn)錄因子和酶的有序調(diào)節(jié)。其中最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子有:①C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族。在分化早期,C/EBPβ和C/EBPδ表達(dá)短暫增加,再激活PPARγ和C/EBPα基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞分化。其中C/EBPα在脂肪細(xì)胞分化的后階段通過上調(diào)PPARγ的表達(dá),保持分化細(xì)胞表型等方面發(fā)揮重要作用。②PPAR轉(zhuǎn)錄因子家族。該家族含3個(gè)亞型:PPARα、PPARδ和PPARγ。其中PPARγ對脂肪細(xì)胞的分化起重要作用,如誘導(dǎo)小脂肪細(xì)胞的形成,調(diào)控乙酰輔酶A合成酶(ACS)、脂肪酸合成酶(FAS)和LPL等的表達(dá)。LPL的表達(dá)是脂肪細(xì)胞分化的早期特征,在控制脂質(zhì)積聚中起重要作用。隨著新合成的脂肪增多,脂肪細(xì)胞開始獲得對胰島素的敏感性,在胰島素的作用下,脂肪細(xì)胞進(jìn)一步增加脂質(zhì)沉積并成熟。在體外誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化時(shí),地塞米松和胰島素是最常用的誘導(dǎo)劑。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)C/EBP-δ的表達(dá),可能促使C/EBP-δ/C/EBP-β異二聚體的形成,C/EBP家族有一個(gè)堿性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)和一個(gè)亮氨酸拉鏈模體,可形成同源或異源二聚體,通過DNA結(jié)合區(qū)結(jié)合于靶基因的調(diào)控元件,如PPAR啟動區(qū)的調(diào)節(jié)元件,調(diào)節(jié)PPAR的表達(dá)。PPARs結(jié)合配體后和視黃酸類受體(RXR)形成異二聚體,然后與其靶基因啟動子上的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(PPRE)結(jié)合調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄,如LPL、乙酰輔酶-A合成酶、脂肪酸合成酶等,誘導(dǎo)小脂肪細(xì)胞的形成,分化和成熟。

之前的研究多數(shù)集中于DHEA對脂肪細(xì)胞分化的影響,而DHEA-S的研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DHEA-S(50 μmol/L)抑制脂肪細(xì)胞的分化,并抑制脂肪細(xì)胞分化率和抑制G3PDH的活性。在關(guān)鍵基因的表達(dá)方面,DHEA-S顯著抑制PPARγ、ADD1/SREBP1-c、C/EBP-α、C/EBP-β、C/EBP-δ和LPL mRNA的表達(dá)。前脂肪細(xì)胞的增殖和分化均需要糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)C/EBP-δ和PPAR-γ的表達(dá)。脂肪組織有豐富的11β-HSD1表達(dá),催化皮質(zhì)酮形成活性皮質(zhì)醇,是局部糖皮質(zhì)激素活化的關(guān)鍵酶。DHEA-S通過抑制11β-HSD1的表達(dá),減少局部活性皮質(zhì)醇的水平,也是DHEA-S抑制脂肪細(xì)胞分化的可能機(jī)制之一。

綜上所述,脂肪細(xì)胞的分化受眾多轉(zhuǎn)錄因子和激素的調(diào)節(jié)。DHEA-S通過抑制11β-HSD1的表達(dá),減少局部活性皮質(zhì)醇;直接或間接抑制前脂肪細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族和PPARγ的表達(dá),進(jìn)而抑制前脂肪細(xì)胞的分化,參與體脂平衡和分布的調(diào)節(jié)。但我們的實(shí)驗(yàn)僅是體外研究的結(jié)果,DHEA-S對機(jī)體脂質(zhì)含量和分布的作用,需要進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中明確。