牡丹花黃酮的超聲輔助提取工藝研究

竇勇博，王成忠

（齊魯工業(yè)大學(xué)＜山東省科學(xué)院＞食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

牡丹屬芍藥科植物，原產(chǎn)中國(guó)西部秦嶺和大巴山一帶，為多年生落葉小灌木。牡丹生長(zhǎng)慢、株型小，是我國(guó)特有的木本名貴花卉，有數(shù)千年的自然生長(zhǎng)和1 500 多年的人工栽培歷史，素有“國(guó)色天香”“富貴之花”“花中之王”等美稱(chēng)。牡丹花具有重要的藥用價(jià)值，含有紫云英苷、沒(méi)食子酸、苯甲酸等黃酮、多酚化合物[1]。黃酮類(lèi)化合物（flavonoids）又稱(chēng)黃體酮、生物類(lèi)黃酮、黃堿素、維生素P，泛指兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)（A-與B-環(huán)）通過(guò)中央三碳原子相互連結(jié)而成的一系列化合物，其基本母核為2-苯基色原酮。近年來(lái)隨著對(duì)黃酮類(lèi)化合物研究的不斷深入，許多天然黃酮類(lèi)化合物被開(kāi)發(fā)出來(lái)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體有許多生理活性，如清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、抗過(guò)敏、抗菌、抗炎、抑制酶的活性、防止血管舒張等作用[2,3]。另外，黃酮類(lèi)化合物在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景也非常廣闊[4,5]。在牡丹花黃酮的提取方面，目前研究還非常少。王曉等[6]研究了酶法提取牡丹總黃酮的工藝條件。王亮生等[7]在研究牡丹花成色機(jī)理時(shí)，對(duì)西北牡丹中的黃酮種類(lèi)和含量進(jìn)行了探索。

黃酮類(lèi)化合物常用的提取方法有水提法、有機(jī)溶劑提取法、堿液提取法、微波提取法、超聲波提取法、超臨界流體萃取、半仿生提取法及酶解法等。用超聲波提取法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)，與普通的有機(jī)溶劑提取法相比具有提取效率高、操作方便、溫度低、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。本試驗(yàn)使用超聲波輔助法提取牡丹花中總黃酮，并通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化得到最佳的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

XFB-400 小型植物粉碎機(jī)，吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；RE100-Pro 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海人和科學(xué)儀器有限公司；UV-1800 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易有限公司；SHB-III 水循環(huán)真空泵，北京博遠(yuǎn)祥德科學(xué)儀器有限公司；DHG-9140A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；KQ-300DB 數(shù)控超聲波清洗器，北京卓信偉業(yè)科技有限公司；YP3001N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HW·SY21-K 電熱恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表有限公司。

1.2 材料與試劑

試驗(yàn)采用菏澤地區(qū)栽種的牡丹花，以曬干的牡丹花為原料，烘干后破碎打粉備用。

蘆丁，天津大茂化學(xué)試劑廠；乙醇，天津大茂化學(xué)試劑廠；三氯乙酸（TCA），天津大茂化學(xué)試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

（1）對(duì)照品溶液的配制

精確稱(chēng)量蘆丁10.0 mg，用70%乙醇溶解，稀釋定容至50 mL，配成0.2 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

（2）顯色劑的配制

精密稱(chēng)取AlCl3·6H2O 2.42 g，用70%乙醇定容至100 mL，配成0.1 mol/mL 的顯色劑溶液。

（3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

從蘆丁對(duì)照品溶液中精密移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 溶液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測(cè)吸光度。以不加蘆丁對(duì)照品溶液為對(duì)照，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品中黃酮含量的測(cè)定

將低溫冷凍的牡丹花于50 ℃低溫烘干，粉碎機(jī)破碎，精確稱(chēng)取一定質(zhì)量的牡丹花粉末（1.0 g），以一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液為溶劑，在一定的料液比下，超聲輔助浸提一段時(shí)間后，浸提液經(jīng)抽濾后加入相應(yīng)濃度的乙醇，定容于100 mL 容量瓶中作為提取液。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測(cè)吸光度，代入回歸方程，計(jì)算提取液中黃酮的含量[11]。

1.3.3 黃酮不同提取方法的比較

（1）傳統(tǒng)浸提法

精確稱(chēng)取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液為溶劑，料液比為1：30，在60 ℃恒溫水浴中浸提2 h，浸提液經(jīng)抽濾后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，在412 nm 處測(cè)吸光度，代入回歸方程，計(jì)算提取液中黃酮的含量。

（2）超聲波輔助提取法

精確稱(chēng)取牡丹花粉末1.0 g，以70%的乙醇溶液為溶劑，料液比為1：30，超聲輔助浸提30 min，浸提液經(jīng)抽濾后定容。吸取1 mL 提取液，加入1 mL、0.1 mol/L 的顯色劑，用70%乙醇定容至25 mL。搖勻，充分顯色15 min，412 nm 處測(cè)吸光度，代入回歸方程，計(jì)算提取液中黃酮的含量。

1.4 超聲波輔助提取黃酮的單因素試驗(yàn)

1.4.1 乙醇濃度對(duì)提取液中黃酮含量的影響

精確稱(chēng)取牡丹花粉末1.0 g，分別以不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，60 ℃、280 W 超聲提取40 min，抽濾定容，然后測(cè)定黃酮含量。

1.4.2 料液比對(duì)提取液中黃酮含量的影響

料液稱(chēng)取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比分別為1：20、1：30、1：40、1：50、1：60，60 ℃、280 W 超聲提取40 min，抽濾定容，然后測(cè)定黃酮含量。

1.4.3 超聲時(shí)間對(duì)提取液中黃酮含量的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取牡丹花粉末（1.0 g），以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，在60 ℃、280 W 超聲波分別超聲提取20、30、40、50、60 min，抽濾定容后，測(cè)定黃酮含量。

1.4.4 超聲溫度對(duì)提取液中黃酮含量的研究

精密稱(chēng)取牡丹花粉末1.0 g，以60%的乙醇溶液為提取溶劑，料液比為1：30，分別在40、50、60、70 ℃條件下，280 W 超聲提取40 min，抽濾定容后，測(cè)定黃酮含量。

1.5 超聲波輔助提取黃酮的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 The factor and level table of orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

經(jīng)線性回歸，得到溶液濃度（x）與吸光度（y）關(guān)系曲線的回歸方程為y=36.97x+0.011，R2=0.998?？梢?jiàn)，在所試驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（x）與吸光度（y）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 超聲波提取法與傳統(tǒng)浸提法的對(duì)比

表2 超聲波提取法與乙醇浸提法的比較Table 2 Comparison between ultrasonic extraction method and ethanol extraction

由表2 可知，超聲波提取法牡丹花總黃酮提取率為2.48%，而傳統(tǒng)浸提法黃酮的提取率為1.93%，超聲波的提取效果比傳統(tǒng)浸提法提高了0.55%。在其他條件相同的前提下，超聲波法提取時(shí)間僅需40 min，與傳統(tǒng)浸提法相比，具有省時(shí)、提取率高、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)采用超聲波輔助法提取牡丹花黃酮。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 乙醇濃度對(duì)牡丹花黃酮提取率的影響

圖1 顯示了乙醇濃度對(duì)提取液中黃酮含量的影響，由圖可知，隨著乙醇溶液濃度的升高，牡丹花總黃酮的提取率不斷增加，但當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，提取率反而下降。原因可能是天然植物中的黃酮類(lèi)化合物多以苷類(lèi)形式存在，而黃酮苷在低濃度乙醇中溶解度較高，在高濃度乙醇中溶解度反而降低，結(jié)果導(dǎo)致提取率也隨之下降。因此，用于牡丹花黃酮提取的乙醇濃度選擇60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

2.3.2 料液比對(duì)牡丹花黃酮提取率的影響

圖2（見(jiàn)下頁(yè)）顯示了料液比對(duì)提取液中黃酮含量的影響，由圖可知，隨著料液比的減小，牡丹花黃酮的提取率不斷增加，但當(dāng)料液比達(dá)到1：30 時(shí)，提取率接近平穩(wěn)。原因可能是隨著料液比的減小，牡丹花的黃酮不斷溶解，但是牡丹花中黃酮含量是有一定限度的，料液比達(dá)到1：30 時(shí)黃酮基本完全溶出，此時(shí)再增加溶劑的用量，提取率的變化不大。因此，料液比選擇1：30。

圖2 料液比對(duì)黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of flavonoids

2.3.3 超聲時(shí)間對(duì)牡丹花黃酮提取率的影響

圖3 顯示的是超聲時(shí)間對(duì)提取液中黃酮含量的影響。由圖可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的提取率逐漸增加，在40 min 時(shí)達(dá)到最高，之后提取時(shí)間再延長(zhǎng)，黃酮的提取率呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。原因是當(dāng)提取時(shí)間過(guò)短時(shí)，牡丹花黃酮提取的不夠充分，沒(méi)有完全溶出，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，牡丹花中其他能溶解到乙醇中的化合物也可能被提取出來(lái)，從而影響黃酮和鋁離子的絡(luò)合，使吸光度下降。因此，提取時(shí)間選擇40 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of flavonoids

2.3.4 超聲溫度對(duì)牡丹花黃酮提取率的影響

圖4 顯示了超聲溫度對(duì)提取液中黃酮含量的影響，由圖可以看出，隨著提取溫度的升高，黃酮的提取率逐漸增加，但當(dāng)溫度上升到60 ℃時(shí)，黃酮的提取率最高，再升高溫度，黃酮的提取率反而下降。原因是溫度過(guò)高時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致一部分黃酮發(fā)生氧化而分解；同時(shí)，會(huì)有部分溶劑揮發(fā)損失，影響到料液比，從而使提取率降低。因此，提取溫度選擇60 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of flavonoids

2.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

從表3 中極差分析的結(jié)果可以看出，四個(gè)因素對(duì)牡丹花黃酮提取率的影響順序依次為乙醇濃度料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度；提取黃酮的最佳條件是A1B2C2D3，即乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間40 min、料液比1：40。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下得到的牡丹花黃酮提取率為2.998%，均高于其他試驗(yàn)組。從表4 顯著性分析中可以看出FD＞FC＞FB＞FA，且FD遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了F 臨界值，這表明料液比對(duì)提取率有顯著性影響，因此采用超聲波輔助提取牡丹花黃酮時(shí)應(yīng)特別注意料液比。

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助提取法提取牡丹花黃酮，優(yōu)化了提取工藝，確定了牡丹黃酮的最佳提取條件，并在此基礎(chǔ)上研究了牡丹黃酮的含量及抗氧化性能。與傳統(tǒng)浸提法相比，超聲波輔助提取方法具有省時(shí)、提取率高、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results

表4 正交試驗(yàn)方差分析Table 4 The variance analysis of orthogonal test

試驗(yàn)還得到，影響牡丹黃酮的提取效果因素的大小順序?yàn)榱弦罕龋咎崛r(shí)間＞提取溫度＞提取溶劑濃度。最佳提取工藝為乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間40 min、料液比1：40。在最佳提取條件下，牡丹花中總黃酮提取率為2.998%。