3D打印材料與脫細胞氣管基質的生物相容性研究

李劍鋒，仲毅，潘子寅，王志豪，潘樞，史宏燦

（1.揚州大學臨床醫(yī)學院 胸外科，江蘇 揚州 225001；2.揚州大學轉化醫(yī)學中心，江蘇 揚州 225001）

先天性氣管軟化塌陷狹窄或閉鎖，后天因外傷、腫瘤、大面積燒傷等原因引起的氣管損傷均會引起嚴重的呼吸困難甚至窒息。切除病變氣管并行端-端側吻合被普遍認為是最有效的治療手段［1-2］。然而當切除的病變氣管長度超過成人的1/2或嬰幼兒的1/3 時，由于張力等原因無法行端-端側吻合，而需行氣管替代治療［3］。人類主氣管是由15～20 個C 形軟骨環(huán)通過平滑肌、血管等結締組織構成，在內表面被覆有纖毛上皮［4］。氣管軟骨維持著氣管的管腔形態(tài)，防止氣管塌陷；而氣管內表面呼吸上皮中的纖毛對氣管的清潔有著重要作用；氣管軟骨周圍的結締組織則保證了氣管的曲伸以及收縮、擴張等機械運動［5］。目前臨床上還無法完全重建如此復雜的多層結構，以及完全恢復其功能。然而，隨著氣管重建研究的深入，組織工程氣管的出現(xiàn)為氣管重建帶來了曙光［6］。

組織工程將種子細胞、支架材料和細胞因子有效結合，從而修復相關組織缺損，進行器官重建［7］。目前構建組織工程氣管基質材料主要有兩個來源：天然材料、合成材料［8］。而隨著研究的深入，目前天然材料主要來源多為同種異體氣管，本研究通過去污劑-聯(lián)合酶法（detergent-enzymatic method,DEM）獲取長段無免疫原性脫細胞兔組織工程氣管，動物實驗證實不影響血管生成性能，也不誘發(fā)體內炎性反應。 聚己內酯（polycaprolactone,PCL）是一種生物可吸收性聚合物，因其分子鏈上的酯基使其具備良好的生物相容性，能夠在體內以合適的速度自然降解并代謝出體外［9］。PCL 熔點低（60℃）、熱塑性良好，因而易加工成型，加之其良好的生物力學性能，獲得美國食品藥品管理局（Food and Drug Administration,FDA）的批準，廣泛應用于生物醫(yī)學以及組織工程［10-11］。本研究通過實驗篩選出200 μm 孔徑PCL 支架最利于細胞黏附增殖，并利用水解、胺化、納米材料修飾的方法，提高3D 打印聚己內脂（PCL）氣管支架的表面親細胞性，增強對細胞的黏附性能。本研究旨在通過對比兩種組織工程氣管基質材料力學性能及生物相容性差別，為構建更為有效的合理的組織工程氣管提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

2 個月齡健康新西蘭兔3 只，雌雄不限，體重200～300 g；6 個月齡成年健康新西蘭兔25 只，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg；均由揚州大學實驗動物中心提供。動物實驗獲揚州大學醫(yī)學院倫理委員會批準。

脫氧膽酸鈉、DNA-I 酶、戊巴比妥（Sigma 公司，美國）；鹽酸賽拉嗪注射液（吉林省華牧動物保健品有限公司）；細胞計數（cell counting kit-8,CCK-8）試劑盒（Biosharp 公司，韓國）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin, HE）染液（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；低分子肝素鈉（深圳天道醫(yī)藥有限公司）；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium, DMEM）、0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美國）；F12（Clark 公司，美國）；Giemsa 染料（北京索萊寶科技有限公司）；青霉素、鏈霉素、兩性霉素B（上海生工生物工程有限公司）；即用型免疫組化試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine, DAB） 顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）；抗兔分化抗原68（cluster of differentiation 68,CD68）單克隆抗體（上海艾博抗貿易有限公司）。

正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）；萬能力學測試機3367（Insteon 公司，美國）；LeicaCM-1990 冷凍切片機（Leica 公司，德國）；正置免疫熒光顯微鏡、TS100 倒置顯微鏡（Nikon 公司，日本）；酶標儀（BioTAK 公司，美國）；S-4800 場發(fā)射掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；CO2培養(yǎng)箱、臺式離心機（Hereaus 公司，德國）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（太倉市實驗設備廠）；壓力蒸汽滅菌（嘉興中新醫(yī)療器械公司）。

1.2 BMSCs分離、培養(yǎng)及傳代

2 個月齡新西蘭兔，按鹽酸賽拉嗪0.2 ml/kg肌肉注射，麻醉成功后用18 號骨髓穿刺針于脛骨平臺處進行穿刺，用經肝素沖過的注射器抽取骨髓約2 ml。按本研究既往的實驗方法［12］，即全骨髓貼壁篩選法進行BMSCs 的分離、培養(yǎng)及傳代。取生長狀態(tài)良好的第4 代BMSCs 用于后續(xù)實驗。

1.3 氣管支架制備及相關檢測

取10 只6 個月齡成年新西蘭兔，空氣栓塞法處死，在外科標準無菌操作下獲取氣管。隨機分為兩組，每組5 只。A1組僅剝離氣管外表面疏松結締組織。B1組在剝離氣管外表面疏松結締組織基礎上，參照本研究既往DEM 法［13］對氣管進行脫細胞處理，簡述如下：①置于4℃蒸餾水滲透溶解48 h；②在4% 脫氧膽酸鈉蒸餾水溶液浸泡37℃孵育4 h；③將氣管在室溫下置2 000 KU/L Dnase-I 的生理鹽水中浸泡3 h；④將②③步驟重復7 次，最后將氣管置于1% 抗生素、抗真菌的PBS 緩沖液中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選用聚己內酯（PCL）為材料，采用打印噴頭在旋轉軸上打印的方式，設置打印溫度為90℃，打印噴頭沿旋轉軸來回移動，打印速度為5 mm/s，先在旋轉軸上打印出底層氣管支架；然后旋轉軸與打印底層時旋轉方向相反，打印成形第二層氣管支架，繼而與上一層形成多孔結構。以此重復打印6 層。氣管支架的孔徑可通過旋轉軸的轉速和打印頭的行走速度調節(jié)，以此制備孔徑為200 μm的PCL 氣管支架。將支架置于濃度為10%的納米二氧化硅溶液中浸泡過夜，第二天取出后室溫放置，5 d 縮合反應完全，得PCL 納米二氧化硅修飾材料。使用游標卡尺對3組氣管支架進行長度、直徑、厚度等形態(tài)學數據進行測量。萬能力學儀行壓縮實驗：給予固定樣本0.1 N 為位移原點，室溫下以10 mm/min 的速率，控制行程為50%管腔直徑開始壓縮實驗［14］，記錄樣本最大應力（N）。

1.4 細胞-氣管支架復合物的制備及相關觀測

1.4.1 細胞-氣管支架復合物制備及細胞活性觀察將A1組、B1組及C1組支架在無菌環(huán)境中修剪成0.5 cm×0.5 cm 大小的片狀組織，然后貼于96 孔板底中央，氣管外壁朝上；吸走周圍PBS 液，置于超凈臺中干燥2 h，向組織片中滴加含10%FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基直至覆蓋組織片，滴加過程避免組織片漂浮。將96 孔培養(yǎng)板移至細胞培養(yǎng)箱，37℃、5%二氧化碳（CO2）、飽和濕度下孵育24 h 后，吸去培養(yǎng)基。取生長狀態(tài)良好的第4 代BMSCs，達80% 融合時消化計數，然后將含有2.5×104個細胞的細胞懸液接種至兩組氣管組織片的外壁上，置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h 后取出行Giemsa 染色，倒置顯微鏡下觀察，根據細胞生長形態(tài)及狀況判斷材料毒性。

1.4.2 掃描電鏡觀察 3組細胞-氣管支架復合物組織片培養(yǎng)24 h 后取出，2.5% 戊二醛溶液固定24 h；PBS 漂洗，梯度乙醇脫水，加入乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）及純戊酯各30 min，干燥后噴金，掃描電鏡觀察支架外表面的細胞狀態(tài)。

1.4.3 CCK-8 檢測 在避光條件下，以1∶10 的體積濃度配制CCK-8：培養(yǎng)基溶液。吸凈24 孔板內待測孔中的培養(yǎng)基，加入500 μl CCK-8 檢測液覆蓋支架表面，置培養(yǎng)箱中反應2 h；取200 μl 上清加入96 孔板中，用酶標儀測定450 nm 波長處的吸光值，減去空白對照的吸光值后得到間接反映活細胞數量的光學密度450（optical densitity 450,OD450）值。

1.5 同種異體動物體內實驗

1.5.1 氣管支架手術埋植 取6 個月齡成年新西蘭兔15 只，隨機分為3組，每組5 只。動物實驗獲揚州大學醫(yī)學倫理委員會批準。以鹽酸賽拉嗪注射液0.2 ml/kg 肌肉注射麻醉，頸背部備皮切開，游離皮下淺筋膜，分離脊柱一側，形成皮囊。每只兔子分別植入3組氣管支架一枚，隨后常規(guī)縫合。術后第一周每天予以青霉素5 萬u/kg 一天一次肌肉注射，在術后30 d 將實驗動物處死，獲取埋植物，拍照后將樣本在室溫下于pH7.4 的10%中性福爾馬林溶液固定24 h，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，石蠟包埋，并制成4 μm 切片備用。

1.5.2 血液免疫球蛋白動態(tài)分析 術后3、7、11、15、19、23、27 d，于耳緣靜脈處采血留取標本，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法評估受體血清免疫球蛋白IgM 和IgG 含量的動態(tài)變化。

1.5.3 HE 染色觀察 將制備好的切片依次行脫蠟、水化、染色、梯度脫水、透明、中性樹脂封片、干燥后正置光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5.4 免疫組化檢查 將制備好的切片依次行脫蠟及水化、抗原修復（酶修復法）、滴加過氧化酶阻斷溶劑（A），室溫下孵育10 min 后滴加非免疫動物血清（B），室溫下孵育10 min 后滴加用PBS稀釋的一抗（CD68 1∶200 稀釋），4℃孵育過夜；滴加生物素標記的二抗（C），室溫下孵育10 min后滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液（D），室溫下孵育10 min 后滴加新鮮配制的DAB 液顯色；蘇木素復染、鹽酸酒精分化、中性樹脂封片，干燥后顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 氣管支架形態(tài)學觀測及生物力學性能檢測

兔原生氣管（Native）、 脫細胞氣管（Decellularized）、3D 打印氣管（材料為PCL）宏觀對比見圖1，各組測量的長度、管腔直徑、及管壁厚度見表1，3組氣管支架形態(tài)學相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 3組氣管支架形態(tài)學測量（±s,mm）

表1 3組氣管支架形態(tài)學測量（±s,mm）

組別原生氣管組脫細胞氣管組PCL氣管組t值P值例數5 5 5長度50.23±0.31 49.63±1.3 50.24±0.51 1.51 0.108直徑8.61±0.35 8.34±0.26 8.75±0.17 1.27 0.156厚度0.88±0.05 0.86±0.08 0.87±0.04 0.76 0.238

圖1 3組氣管宏觀對比圖

壓縮實驗結果見表2，結果提示C1組力學性能優(yōu)于B1組，具有更好的側向抗壓維持管腔形狀能力。

表2 3組氣管支架生物力學性能對比（±s）

注：1）與原生氣管組比較，P ＜0.05；2）與脫細胞氣管組比較，P ＜0.05。

組別原生氣管組脫細胞氣管組PCL氣管組F值P值例數5 5 5管腔形變50%時最大應力/N 2.261±0.165 1.414±0.2841)5.004±0.0011)2)298.82 0.000彈性模量/mPa 0.598±0.129 0.334±0.0581)1.744±0.1641)2)132.29 0.000

2.2 細胞-氣管支架復合物相關觀測

2.2.1 細胞活性觀察 培養(yǎng)48 h 后Giemsa 染色示，3組材料周圍的細胞均貼壁生長良好，A1與B1兩組材料周圍的細胞在形態(tài)無明顯差別，B1組材料周圍局部密度較其他兩組更高，PCL 組可見少量懸浮細胞，見圖2。

2.2.2 掃描電鏡觀察 培養(yǎng)24 h 后經SEM 觀察到細胞在3組支架材料外壁上貼附良好，A1、B1組外側的網狀纖維上可見細胞呈扁平的圓形、橢圓形分布，BMSCs 在C1組材料外壁上呈簇狀生長，局部為串珠樣分布，如圖3。

2.2.3 CCK-8 檢測 CCK-8 試劑中含有WST-8：化學名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪-硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（formazan）。生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。統(tǒng)計分析各組不同時段的OD 值，見表3。B1組的細胞增殖數量要高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 3組細胞-氣管支架復合物培養(yǎng)48 h 后Giemsa 染色觀察（倒置顯微鏡×40）

圖3 種細胞前后3組細胞-氣管支架材料掃描電鏡觀察

2.3 同種異體動物體內實驗

2.3.1 大體觀察 所有實驗動物術后30 d 內表現(xiàn)健康，體重有所增加；傷口均愈合良好。30 d 時B2組氣管支架周圍包繞炎性結締組織，并與受植床粘連，不易剝離；囊狀的新鮮氣管內有大量膿液積聚，破壞了正常氣管的解剖結構；C2組被炎性肉芽組織包裹，易剝離。見圖4。

2.3.2 血液免疫球蛋白動態(tài)分析 術后3組IgM及IgG 表達均逐漸增加，分別于1 d 和15 d 達峰值，后逐漸下降，符合體液免疫應答抗體產生的規(guī)律。術后各時間點C2組IgM 和IgG 含量均顯著高于B2組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖5。

2.3.3 HE 染色觀察 術后30 d A2組炎性細胞浸潤較多，以單核細胞、淋巴細胞浸潤為主，腺體結構缺失，軟骨組織不同程度被破壞；C2組以嗜酸性粒細胞浸潤為主，呈異物肉芽腫性炎癥反應，結構保持良好，而B2組較其他兩組炎癥細胞浸潤最少，軟骨細胞形態(tài)無異常，未見鈣化、排斥等不良反應。見圖6。

表3 3組材料上種植干細胞不同時間點CCK-8 檢測（±s,×104個/ml）

表3 3組材料上種植干細胞不同時間點CCK-8 檢測（±s,×104個/ml）

注：1）與原生氣管比較，P ＜0.05；2）與脫細胞氣管比較，P ＜0.05。

組別A1(原生氣管)B1(脫細胞氣管)C1(3D打印氣管)F值P值例數5 5 5 1 d 0.080±0.002 0.104±0.0111)0.091±0.0052)11.04 0.017 3 d 0.134±0.006 0.216±0.0211)0.131±0.0202)24.32 0.001 5 d 0.421±0.014 0.495±0.0111)0.444±0.0112)28.84 0.001 7 d 0.417±0.015 0.455±0.028 0.438±0.012 2.9 0.132

2.3.4 免疫組化 術后30 d A2組基質斷裂，軟骨凹陷內細胞核消失，可見黏膜及黏膜下層內有大量CD68 表達陽性巨噬細胞，細胞膜呈棕色；C2組結構保持完整，管腔內側同樣可見CD68 表達陽性巨噬細胞浸潤；B2組巨噬細胞浸潤明顯少于上述兩組。見圖7。

圖4 埋植前后對比圖（30 d）

圖5 術后免疫球蛋白動態(tài)監(jiān)測結果

圖6 術后30 d HE 染色（A、B、C×100）

圖7 術后30 d 免疫組化CD68 抗原染色（A、B、C×100）

3 討論

細胞外基質是組織工程的重要組成部分，是種子細胞生存的土壤，直接影響種子細胞黏附、增殖、分化，最終促進組織再生和重塑［15-16］。目前不管是以脫細胞基質為基礎［17］，還是以生物合成支架為基礎［18］的方法都被廣泛用于組織工程氣管研究。脫細胞基質材料含有天然的細胞外基質成分，不會釋放有毒的可降解產物或引起炎性反應［19］。但同樣脫細胞體外處理周期時間較長、處理環(huán)節(jié)多，消耗較多人力、物力以及污染風險較大，缺乏供體來源等都一定程度限制其發(fā)展［20］。而通過3D 打印技術制備的PCL 氣管支架具有：①精度高；②速度快，周期短；③個體化；④種子細胞與支架材料同步化［21-22］等優(yōu)點。如何利用這兩種基質材料的優(yōu)點構建更加合理有效的人工氣管成為目前組織工程氣管的研究熱點。

氣道的重建首先有合適的外形和強度來維持其管腔的形態(tài)［23］，若無法維持管腔形態(tài)術后早期即可能出現(xiàn)管腔塌陷、狹窄等情況。通過力學性能檢測發(fā)現(xiàn)PCL 氣管支架較脫細胞氣管支架有明顯優(yōu)勢。而脫細胞支架力學性能的下降考慮與在脫細胞過程中氣管中的可溶性膠原等的喪失有關［24］。

要成為可應用于臨床的組織工程氣管支架材料，必須能支持種子細胞黏附、增殖、分化。本實驗將BMSCs 接種至兩種氣管支架外壁上進行體外培養(yǎng)，并觀察細胞的黏附、生長情況。SEM 結果顯示，BMSCs 在兩種氣管支架外壁上均貼附良好，細胞呈扁平的圓形、橢圓形，排列緊密，成簇分布，甚至可以看到PCL 基質材料表面附著有更多的細胞。因此，推測脫細胞基質與修飾后的PCL 氣管基質材料均可以提供一個良好的細胞黏附界面，并且可以提供細胞增殖生長的環(huán)境。PCL材料表面附著有更多的細胞考慮與材料適宜的孔徑結構以及修飾后原本疏水材料表面可供黏附的附著點增加有關［25］。而Giemsa 染色及CCK-8 檢測均提示，脫細胞氣管組細胞毒性最小，所能提供的環(huán)境最有利于細胞增殖。所以，PCL 氣管支架雖更有利于細胞黏附，但其生長增殖的環(huán)境不及脫細胞氣管支架。

生物材料的性能要求一方面必須滿足功能性，另一方面必須滿足與生物長期或短期接觸所需要的與生物體的相容性［26］。本研究中術后監(jiān)測血清中IgG、IgM 的變化，標本取出后行HE 染色及免疫組化巨噬細胞特異性抗原CD68 檢測。根據免疫球蛋白的監(jiān)測情況，IgM 首先出現(xiàn)峰值，IgG 則在2 周以后達到最高峰，這與這兩種球蛋白自身特點相符，2 周時PCL 氣管組IgG 與IgM 均明顯高于另兩組，到4 周時3組結果基本一樣，說明在炎癥反應的急性期PCL 氣管組對于機體的刺激較其他兩組高。HE 染色可見原生氣管組內有大量的單核巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞等浸潤，呈現(xiàn)非特異性慢性炎癥，PCL 支架則以嗜酸性粒細胞浸潤為主，呈現(xiàn)異物肉芽腫性炎癥。兩者截然不同的炎癥反應結果，考慮與材質的本身表面的抗原有關系，PCL 支架表面無抗原，無法形成抗原遞呈反應，最終結果會形成纖維包裹和異物肉芽腫，另外可出現(xiàn)嗜酸性粒細胞浸潤現(xiàn)象，這可能是異物刺激引起自身免疫反應的結果［27］。

綜上所述，本實驗通過對脫細胞氣管支架及PCL 氣管材料的體外、體內生物學性能檢測，證實PCL 氣管支架具有良好的生物力學性能，脫細胞氣管具有低免疫原性、適宜細胞增殖及良好的生物相容性，兩種支架材料的相對優(yōu)勢可為構建多層結構雜化式組織工程氣管提供依據。