基于LPS/TLR4通路研究疏肝理脾湯治療NASH大鼠的作用機(jī)制*

王 雅 劉玉娟 代 靜 張 濤△

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (湖南 長(zhǎng)沙， 410007) 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是指在非酒精性肝病(NAFLD)基礎(chǔ)上，肝臟發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的一種病理表現(xiàn)，是進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌的必經(jīng)步驟[1]。近年來(lái)，多項(xiàng)研究證實(shí)NAFLD患者腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致增殖的脂多糖(LPS)激活Toll樣受體(TLR4)信號(hào)通路，引發(fā)炎性/負(fù)炎性細(xì)胞因子嚴(yán)重失衡[2]，從而導(dǎo)致NASH發(fā)生及進(jìn)展。本課題組基于中醫(yī)“肝病實(shí)脾理論”，認(rèn)為NASH病因病機(jī)均與“脾虛”相關(guān)，在前期以“健脾、益氣、活血、利濕”為代表的“實(shí)脾理論”治療NASH的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，其在改善中醫(yī)癥候、肝功能、血脂水平等方面具備優(yōu)勢(shì)[3、4]。以“疏肝健脾活血”立法的疏肝理脾湯源于疏肝健脾名方柴芍六君湯，在我院近40年的臨床應(yīng)用實(shí)踐表明，其在改善肝臟炎癥、纖維化方面療效顯著，是我院治療慢性肝病經(jīng)典復(fù)方。故本研究擬從LPS-TLR4信號(hào)通路角度出發(fā)，探討基于“疏肝健脾活血法”立方的疏肝理脾湯治療NASH的干預(yù)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康、成年清潔級(jí)SD雄性大鼠100只，體質(zhì)量(180 g±10 g)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SYXK(湘)2013-0005，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物制備 疏肝理脾湯組成(成人劑量)：柴胡、茯苓、白芍各15 g、茜草、白茅根、地龍各10 g、湘曲、砂仁、鱉甲各5 g組成。所有中藥由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。采用傳統(tǒng)中藥熬制方法煎制，經(jīng)水浴濃縮至生藥含量2.0 g/ml,4℃保存?zhèn)溆谩５鞍彼崮憠A缺乏(MCD)配方：L-氨基酸175.7 g/kg、玉蜀黍淀150 g/kg、右旋麥芽糖50.0 g/kg、纖維素30.0 g/kg、玉米油100.0 g/kg、碳酸氫鈉7.4 g/kg、鹽混合物35.0 g/kg、維生素混合物10.0 g/kg)。購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 TLR4抗體(Abcam公司)，TLR引物(生工生物工程(上海)股份有限公司)，HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗(Proteintech公司;型號(hào)：SA00001-2)，微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司)，Tirol( 生工生物工程(上海)股份有限公司;型號(hào)B610409)，一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司;型號(hào)B639277]，RIPA蛋白裂解液(CWBIO；CW2334S)，5X SDS-PAGE loading buffer(CWBIO，CW0027S)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(CWBIO，CW0014S)；彩色預(yù)染蛋白marker(Therm(Fermentas)，26616)；速泳SDS-PAGE電泳液(CWBIO，CW2566)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(CWBIO，CW0022)；Western抗體稀釋液(CWBIO，CW2340S)；PVDF膜0.45um(millipore，IPVH00010)；PVDF膜 0.22um(millipore，ISEQ00010)；BSA(roche，G5001)；TWEEN 20(Solarbio，T8220)；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(CWBIO，CW0049)；羊抗鼠二抗(PROTEINTECH，SA00001-1)；羊抗兔二抗(PROTEINTECH，SA00001-2)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模階段 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)入對(duì)照組，給予正常飲食，剩余 90只入實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組給予MCD飲食，投食量每只為10 g/100 g體重，飲水量每天為12 ml/100 g體質(zhì)量。各大鼠每周分別稱重，按相應(yīng)體重調(diào)整投食及飲水量，根據(jù)大鼠生長(zhǎng)情況，每天稱重調(diào)整攝食量及飲水的用量。在給予相應(yīng)飼料后，每天觀察動(dòng)物進(jìn)食、飲水、行為、活動(dòng)、精神狀態(tài)、毛發(fā)及大小便等情況。共飼養(yǎng)5周后，隨機(jī)抽取6只大鼠進(jìn)行肝臟病理切片檢測(cè)，評(píng)判造模是否符合人類NASH 病情演變和病理特點(diǎn)。光學(xué)顯微鏡下觀察造模組可見(jiàn)廣泛彌漫性大泡性脂肪變性及肝細(xì)胞氣球樣變，腺泡內(nèi)可見(jiàn)明顯點(diǎn)、灶狀壞死，散在可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；正常組肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,胞漿清透，大小一致，肝竇清晰，提示造模成功。

1.4.2 分組與給藥 造模成功后，將84只大鼠按隨機(jī)原則分為6組，每組14只，其中兩組為無(wú)中藥干預(yù)對(duì)照組，分別繼續(xù)予以MCD飲食(MM組)和正常飲食(MN組)，給予等量蒸餾水灌服；兩組為繼續(xù)MCD 飲食加中藥干預(yù)，中藥干預(yù)分為中藥低劑量(D低組)、高劑量(D高組)；兩組為正常飲食加中藥干預(yù)，分為中藥低劑量(Z低組)、高劑量(Z高組)。另設(shè)對(duì)照組(N組)，為同批次非造模大鼠，不做藥物處理。

參照陳奇主編《中藥藥理研究方法學(xué)》第2版(2006年人民衛(wèi)生出版社)計(jì)算給藥劑量，大鼠與成人的換算系數(shù)Rab為0.162，根據(jù)換算公式，換算出大鼠的給藥量為3.09 g/kg(中劑量)。疏肝理脾湯低、高給藥劑量比例為1∶4。使用蒸餾水將中藥湯劑配成低濃度、高濃度分別為0.07 g/ml、0.31 g/ml備用。復(fù)方中藥制劑，蒸餾水給予時(shí)間均為每日14∶30，持續(xù)4周,于實(shí)驗(yàn)9周末處死所有動(dòng)物。

1.4.3 標(biāo)本采集 予3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹壁下麻醉注射，腹主動(dòng)脈取血，分離血清。濾紙吸濕后，取0.3 g肝組織，放入玻璃杯中，加入0.9%氯化鈉溶液，4℃，3500 r/min離心機(jī)離心10 min，勻漿提取上清液。

1.4.4 指標(biāo)檢測(cè) 療程結(jié)束后，取腹主動(dòng)脈血，羅氏全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。用ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α。取門靜脈血1 ml，離心后取血漿，按照鱟試劑盒說(shuō)明說(shuō)操作檢測(cè)LPS。細(xì)胞炎癥因子檢測(cè)用ELISA 法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-6、IL-1含量。肝組織勻漿液予實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)TLR4mRNA，各組大鼠按照TLR4試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)RNA抽提，反轉(zhuǎn)錄成cDNA,TLR4上游引物GAGGCAGCTCTTGGTGGAAGTTG；下游引物CAAGCACACTGAGGACCGACAC，產(chǎn)物長(zhǎng)度137bp。依次進(jìn)行梯度PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物電泳操作，凝膠成像系統(tǒng)觀察。

Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟：組織總蛋白提?。?1)組織塊用冷PBS洗滌2～3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿器。加入10倍組織體積本試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)冰上徹底勻漿。如果需要提高蛋白濃度，可以適量減少該試劑體積。(2)將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，振蕩,冰浴 30min，期間用移液器反復(fù)吹打，確保細(xì)胞完全裂解。(3)12 000 g離心10 min，收集上清液，即為總蛋白溶液。蛋白濃度測(cè)定：BCA法測(cè)蛋白濃度；SDS-PAGE電泳。

1.5 SAF積分評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 大鼠肝組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)關(guān)于肝組織活檢采用歐洲脂肪肝協(xié)組織提出的肝臟炎癥活動(dòng)積分SAF積分(肝脂肪變+肝細(xì)胞損傷+炎癥壞死)進(jìn)行判斷[1、5]。SAF計(jì)分=肝脂肪變+氣球樣變+小葉炎癥；SAF<3分，排除NASH，SAF>4診斷NASH，介于兩者間，伴有小葉炎癥，氣球樣變?cè)\斷為NASH。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，N組大鼠無(wú)死亡，因麻醉意外，MN組死亡1只大鼠、Z高組、MM組分別死亡2只大鼠，因灌胃操作失誤，MN組、MM組、D高組、D低組各死亡1只大鼠。

2.1 肝臟組織肉眼表現(xiàn) N組大鼠肉眼見(jiàn)呈紅褐色，邊緣銳利，被膜光滑，觸診質(zhì)地柔軟，有彈性；MN組、MM組大鼠肉眼見(jiàn)呈黃褐色，體積較正常組稍大，表面可見(jiàn)散在白色斑點(diǎn)，觸診質(zhì)地有油膩感；Z高組、Z低組、D高組、D低組肉眼見(jiàn)呈黃褐色，體積較正常組稍大，觸診質(zhì)地稍柔軟伴有油膩感，彈性較正常組稍減弱。

2.2 肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 電鏡下N組大鼠肝小葉及肝竇結(jié)構(gòu)完整，肝索排列完整且清晰可見(jiàn)，無(wú)脂肪變及氣球樣變。MN、MM組大鼠肝小葉和肝竇結(jié)構(gòu)欠完整，肝索排列紊亂，可見(jiàn)明顯脂肪變，伴隨大量氣球樣變，腺泡內(nèi)可見(jiàn)大量點(diǎn)灶狀壞死，門管區(qū)稍見(jiàn)星芒狀纖維化；Z高組、Z低組、D高組、D低組可見(jiàn)輕、中度脂肪性變，可見(jiàn)散在氣球樣變，腺泡內(nèi)可見(jiàn)散在點(diǎn)灶狀壞死。

2.3 各組大鼠SAF積分表 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠SAF積分

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，#P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05,△P<0.01；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05。

2.4 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)結(jié)果 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

與N組比較，*P<0.05,與MN組比較，△P<0.05，與MM組比較，▲P<0.05; 與Z高組比較，

#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05, 與D高組比較，@P<0.05。

2.5 血清細(xì)胞炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清細(xì)胞炎癥因子比較

與N組比較，*P<0.05；與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05，與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.6 血漿LPS水平比較結(jié)果 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠血漿LPS水平比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，

☆P<0.05,△P<0.01；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)肝組織 TLR4mRNA結(jié)果 見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠肝組織TLR4mRNA表達(dá)比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，

☆P<0.05；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

2.8 Western Blot法測(cè)TLR4蛋白水平的表達(dá)灰度分析結(jié)果 見(jiàn)表6、圖1。

表6 各組大鼠肝組織中TLR4蛋白靶基因/actin比值比較

與N組比較，*P<0.05;與MN組比較，△P<0.05；與MM組比較，☆P<0.05；與Z高組比較，#P<0.05；與Z低組比較，&P<0.05

圖1 Western Blot法TLR4蛋白印跡圖

3 討論

中醫(yī)理論對(duì)于NASH無(wú)特定病名，多依照“痞病”、“肥胖病”、“肝癖”、“肝痞“、“脅痛”等疾病論治，其病因病機(jī)復(fù)雜，早期多見(jiàn)脾氣虛，繼之肝郁氣滯，脾虛益甚，日久肝脾腎俱虛，但無(wú)論是肝郁還是腎虛，都與脾密切相關(guān)[6]?！案尾?shí)脾”理論源于《金匱要略》“夫治未病者，見(jiàn)肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”，“實(shí)脾”已涵蓋“疏肝、健脾、祛濕、化瘀”諸治法，故基于“肝病實(shí)脾”理論指導(dǎo)NASH臨證論治是目前中醫(yī)治療NASH主要理論之一[7]。

以“疏肝健脾活血”立法的“疏肝理脾湯”是我院治療慢性肝病經(jīng)典復(fù)方，其源于疏肝健脾名方“柴芍六君湯”。該方由柴胡、茯苓、白芍、茜草、白茅根、地龍、湘曲、砂仁、鱉甲組成。方中柴胡疏肝行氣為君，茯苓益氣健脾，健胃消食為臣，白芍養(yǎng)血柔肝為佐，地龍、湘曲、砂仁、鱉甲滋陰潛陽(yáng)，健脾消食為佐。在我院近40年的臨床應(yīng)用實(shí)踐表明，對(duì)改善各類慢性肝病肝臟炎癥、纖維化方面，尤其伴有腹脹、腹瀉，大便不調(diào)等“脾虛”癥狀臨床療效顯著。

TLR4隸屬于表面模式識(shí)別受體(PRR),是存在于細(xì)胞膜的一種跨膜蛋白，通過(guò)識(shí)別特異性LPS的細(xì)胞膜受體，激活肝星狀細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞等，是NASH中關(guān)鍵的炎癥信號(hào)通路[8～9]。研究證實(shí)內(nèi)毒素越過(guò)腸道屏障進(jìn)入腸壁組織、腸系膜淋巴結(jié)，通過(guò)門靜脈進(jìn)入肝臟，參與刺激TLR4蛋白表達(dá)，激活機(jī)體免疫介導(dǎo)的IL-4、IL-6炎癥細(xì)胞因子增殖，從而導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥形成，是NASH重要發(fā)病機(jī)制之一[10]。臨床試驗(yàn)研究證實(shí)NASH 受試者肝組織中TLR4表達(dá)明顯高于正常受試者表達(dá)，且與炎癥程度和纖維化程度呈正相關(guān)；大量增殖的革蘭陰性菌和LPS，與門靜脈血漿內(nèi)毒素水平呈正相關(guān)。上述研究說(shuō)明內(nèi)毒素聚集啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)，激活TLR4信號(hào)通路，引發(fā)炎性/負(fù)炎性因子嚴(yán)重失衡，誘導(dǎo)肝臟的炎癥反應(yīng), 從而促進(jìn)NAFLD進(jìn)展為NASH[11]。故減少腸源性LPS血癥，抑制肝臟組織TLR4信號(hào)表達(dá)，從而減輕脂肪肝相關(guān)炎性反應(yīng)，已成為治療NASH的新策略。

本研究以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，結(jié)合多年我院臨床實(shí)踐，予疏肝理脾湯治療NASH大鼠，研究結(jié)果顯示：從肝臟組織病理上，證實(shí)具有縮小肝細(xì)胞脂變范圍，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的作用；從生化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)具有顯著降低其外周血ALT、AST、TC、TG、IL-1、IL-6及TNF-α水平的作用；以上結(jié)果說(shuō)明疏肝理脾湯具有較強(qiáng)的降低血脂、保護(hù)肝細(xì)胞、減輕NASH炎癥細(xì)胞增生反應(yīng)作用。本研究同時(shí)對(duì)LPS/TLR4信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示疏肝理脾湯干預(yù)治療后，可顯著降低NASH大鼠血漿LPS水平、抑制肝臟組織TLR4信號(hào)表達(dá)；進(jìn)一步分析以疏肝理脾湯高、低劑量、繼續(xù)MCD飲食及正常飲食不同的四組，進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，疏肝理脾湯高劑量聯(lián)合正常飲食組的以上述指標(biāo)評(píng)價(jià)的療效優(yōu)于其余三組。

綜合上述研究，“疏肝健脾湯”對(duì)NASH大鼠的干預(yù)機(jī)制可能與其影響LPS/TLR4信號(hào)通路，從而達(dá)到抑制相關(guān)炎癥細(xì)胞因子分泌，減輕肝細(xì)胞炎性反應(yīng)及脂肪變性的目的。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)通過(guò)改變飲食，療效得到顯著提高，其機(jī)制有待下一步深入研究。