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    健脾清化飲對非酒精性脂肪性肝病大鼠TLR4/NF-κB/TNF-α信號通路的影響*

    2019-09-05 02:27:36張海鷗林清香許夢君王玉衡陳佳霖蔡艷青陳燕山
    關(guān)鍵詞:清化健脾肝臟

    張海鷗 林清香 許夢君 王玉衡 周 凡 陳佳霖 蔡艷青 陳燕山

    1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院脾胃科 (福建 福州, 350003) 2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 3.福建省中醫(yī)藥研究院 4.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院

    非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的,病變主體在肝小葉,以彌漫性肝細(xì)胞大泡性或以大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪過度貯積為特征的臨床病理綜合征。近年來在全球范圍內(nèi)其發(fā)病年齡呈逐漸年輕化,同時帶來的肝硬化、肝癌等并發(fā)癥發(fā)病率也呈上升趨勢,越來越受到人們的關(guān)注與重視[1~4],因此早期積極有效治療NAFLD對防治肝硬化及肝癌具有重要意義。本研究通過NAFLD模型大鼠實(shí)驗(yàn),初步探討健脾清化飲對NAFLD大鼠肝臟內(nèi)Toll樣受體4(TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(NF-κB)/腫瘤壞死因子(TNF)-α信號通路的影響,闡明其治療作用及分子機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠24只,體質(zhì)量(200±20)g,購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司[許可證號:SCXΚ(湘)2016-0002]。

    1.2 主要試劑和儀器 健脾清化飲組成:黨參、白術(shù)、枳殼、茵陳、黃連、豆蔻、佩蘭、薏苡仁,由福建省藥監(jiān)局批準(zhǔn)(閩藥制字Z05104030),經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室生產(chǎn)和提供。常規(guī)煎液濾過,濃縮至含生藥0.33 g/ml、0.66 g/ml。按照成人(按平均體質(zhì)量60 kg計(jì)算)標(biāo)準(zhǔn)用藥量30 ml/d換算,大鼠低、高劑量分別為3.3 g/kg、6.6 g/kg。高脂飼料由南京盛民科研動物養(yǎng)殖場提供;蘇木素染液、伊紅染液(BOSTER 公司,批號分別為AR11800-1、AR11800-2);TNF-α ELISA試劑盒(美國Abcam公司);Trizon Reagent、HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture、Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司,批號分別為CW0580S、CW2569M、CW0957M、CW0581M);兔TLR4、髓樣分化因子88(MyD88)及NF-κB多克隆抗體(Bioss公司,批號分別為bs-20379R、bs-1047R、bs-0456R);兔單克隆抗體GAPDH、兔抗鼠IgG、羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);BPN-80CWCUV CO2培養(yǎng)箱(上皓莊儀器有限公司);CX41顯微鏡(OLYMPUS公司);RT-6100酶標(biāo)儀(Rayto公司);TGL-16G低溫高速離心機(jī)(常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司);UV-1600PC紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司);Chemi DocTM XRS+超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)、CFX Connect實(shí)時熒光PCR儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

    1.3 NAFLD大鼠模型構(gòu)建[5,6]24只SPF級雄性SD大鼠均是適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組,正常對照組6只,造模組18只,正常對照組給予普通飼料喂養(yǎng),造模組給予高脂飼料喂養(yǎng),4周后正常對照組隨機(jī)取1只,造模組隨機(jī)取3只,取肝臟組織進(jìn)行HE染色,觀察肝臟脂肪變性,判斷NAFLD模型是否成功。

    1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 造模成功以后,正常對照組大鼠予普通飼料喂養(yǎng),同時每日給予生理鹽水10 ml/kg灌胃。將造模組余下造模成功的15只大鼠隨機(jī)分為模型組(n=5)、中藥低劑量組(n=5)、中藥高劑量組(n=5),3組大鼠均繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng),同時模型組每日給予生理鹽水(10 ml/kg)灌胃,中藥低劑量組每日給予健脾清化飲3.3 g/kg灌胃,中藥高劑量組每日給予健脾清化飲6.6 g/kg灌胃,每日灌胃1次,每周稱重1次以調(diào)整給藥量,持續(xù)灌胃8周后處死大鼠取材。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測 各組大鼠在末次給藥后,禁食不禁水12 h,以10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔麻醉,腹主動脈采血,利用全自動生化分析儀檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C含量及ALT、AST活性;摘取肝臟,稱取肝臟濕重量,計(jì)算肝指數(shù)=肝濕重/體質(zhì)量×100%,然后肝切成四份,分別進(jìn)行HE染色、油紅O染色、Western Blot檢測和熒光定量PCR檢測。

    1.5.1 肝組織病理觀察 先觀察肝臟大體標(biāo)本的大小、色澤、質(zhì)地、切面等情況;再將肝組織用10%的甲醛溶液固定,固定組織常規(guī)處理,石蠟包埋,切成4 μm切片,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行脫蠟和水化,所有組織切片進(jìn)行HE染色、油紅O染色,光鏡下觀察肝脂肪變性情況。

    1.5.2 TNF-α含量測定 取適量肝組織勻漿后,采用胰酶消化進(jìn)一步消化,接著根據(jù)TNF-α ELISA試劑盒說明書測定TNF-α含量。

    1.5.3 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 采用Trizon 裂解液裂解組織,并根據(jù)超純RNA提取試劑盒提取組織中總mRNA,采用紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度及純度,當(dāng)1.8≤A260/A280≤2.0時,通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成cDNA,接著進(jìn)行熒光定量PCR。操作體系:RNase Free dH2O 9.5 μl、cDNA/DNA 1 μl,、上游引物 1 μl、下游引物1 μl、2×ULtraSYBR Mixture 12.5 μl。反應(yīng)程序:預(yù)變性 95℃ 10 min,變性 95℃ 10 s、退火57℃、30 s、延伸 72℃ 30 s、40個循環(huán)。溶解曲線 95℃ 15 s、57 ℃ 1 min。

    1.5.4 Western Blot分析 RIPA裂解液裂解肝組織勻漿,12 000 r/min 離心10 min,收獲蛋白,煮沸變性。配置10%分離膠及5%濃縮膠,上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h,一抗溶液(兔TLR4、MyD88及NF-κB多克隆抗體)4℃過夜,第2天室溫孵育二抗2 h,滴加曝光液,在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

    2 結(jié)果

    2.1 各級實(shí)驗(yàn)大鼠生化指標(biāo)比較 與正常對照組比較,模型組中TC、TG、LDL-C含量及ALT、AST活性均顯著提高(P<0.01),HDL-C含量降低(P<0.01);與模型組比較,健脾清化飲低、高劑量組中TC、TG、LDL-C含量及ALT、AST活性均顯著降低(P<0.01),HDL-C含量上升(P<0.01)。見圖1。

    2.2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟組織病理變化情況 正常對照組大鼠的肝組織病理顯示無明顯的脂肪細(xì)胞浸潤,模型組大鼠可看出肝組織被大量脂肪細(xì)胞浸潤;健脾清化飲低、高劑量組大鼠脂肪細(xì)胞浸潤較模型組減輕,其中高劑量組的脂肪浸潤程度較低劑量組少,見插頁圖2、3。

    圖1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠生化指標(biāo)檢測結(jié)果

    與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    2.3 各組實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織TNF-α含量比較 與正常對照組比較,模型組中TNF-α含量顯著提高(P<0.01);與模型組比較,健脾清化方低、高劑量組中TNF-α含量顯著降低(P<0.01)。見圖4。

    2.4 各組實(shí)驗(yàn)大鼠TLR4/MyD88/NF-κB mRNA表達(dá)情況 與正常對照組比較,模型組中TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,健脾清化方低、高劑量組中TLR4、MyD88及NF-κB mRNA表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖5。

    圖4 各組大鼠肝組織TNF-α含量比較

    與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    圖5 各組大鼠TLR4/MyD88/NF-κB mRNA表達(dá)情況

    與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    2.5 各組實(shí)驗(yàn)大鼠TLR4/MyD88/NF-κB 蛋白表達(dá)情況 與正常對照組比較,模型組中TLR4、MyD88及NF-κB 蛋白表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01);與模型組比較,健脾清化方低、高劑量組中TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)。見圖6。

    與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01

    3 討論

    根據(jù)NAFLD的臨床癥狀,可將其歸屬于“脅痛、肝著、痰證、脂滿”等病范疇,許雪荷等[7]認(rèn)為本病的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí),本虛以脾氣虧虛為主,標(biāo)實(shí)以氣滯、痰濕、血瘀壅滯于肝;侯麗等[8]認(rèn)為NAFLD發(fā)病多與氣滯痰凝、濕熱因素有關(guān);梁浩衛(wèi)等[9]認(rèn)為本病由久病體虛、飲食失調(diào)、情志不暢所致,病理因素為氣滯血瘀、痰濕蘊(yùn)結(jié),病位主要在肝,與腎、脾、胃等臟腑關(guān)系密切。楊春波主任從“脾”論治肝,結(jié)合閩南濕熱氣候,認(rèn)為“虛、濕、熱”是本病的主要病理變化。

    健脾清化飲是國醫(yī)大師楊春波主任醫(yī)師在其原有經(jīng)驗(yàn)方“清化飲”的基礎(chǔ)上加減而成,應(yīng)用于脾虛濕熱證患者,療效顯著,該方的主要組成藥物有黨參、白術(shù)、枳殼、茵陳、黃連、豆蔻、佩蘭、薏苡仁等,整方共奏健脾益氣、清熱化濕之功,其中黨參、白術(shù)健脾益氣,針對NAFLD疾病本質(zhì)脾虛,脾盛則濕得以除,茵陳、黃連苦寒清熱燥濕、瀉火、解毒,主要針對病理因素(濕熱)及病理變化(炎癥),豆蔻、佩蘭、薏苡仁健脾化濕,以助君臣藥物健脾化濕之力,標(biāo)本兼治。

    NAFLD的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全明確,目前廣泛接受的是由Day等提出的“二次打擊”理論,“第一次打擊”肝臟脂質(zhì)過度沉積產(chǎn)生胰島素抵抗作用;“第二次打擊”則是肝臟脂質(zhì)代謝紊亂后的氧化應(yīng)激所帶來的損傷,是在“第一次打擊”的基礎(chǔ)上進(jìn)一步產(chǎn)生的肝臟慢性炎癥,炎癥細(xì)胞浸潤及相關(guān)機(jī)制貫穿整個“二次打擊學(xué)說”,因此抑制炎癥反應(yīng)能一定程度上減緩NAFLD病程[10,11]。近來研究發(fā)現(xiàn),TLR4/NF-κB/TNF-α信號通路在NAFLD的發(fā)展中起重要作用,TLR4是細(xì)胞表面識別病原體的一種受體,也是革蘭陰性菌細(xì)胞壁主要組成成分脂多糖(LPS)的模式識別受體。NALFD患者腸道菌群紊亂,產(chǎn)生了大量LPS,進(jìn)而刺激TLR4表達(dá)并與之結(jié)合,繼而誘導(dǎo)下游信號通路,促使大量炎癥因子合成、釋放,最終導(dǎo)致肝臟炎癥反應(yīng),肝細(xì)胞死亡,肝臟損傷[12~15]。TLR4介導(dǎo)的下游信號通路主要有MyD88依賴性及非依賴性途徑,其中依賴性途徑主要通過MyD88及IL-1受體相關(guān)激酶相互作用,激活TNF-受體相關(guān)因子6(TRAF6),活化的TRAF6能夠進(jìn)一步的激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合物,使下游信號NF-κB活化,促使AP-1轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入細(xì)胞核,誘導(dǎo)炎癥因子的轉(zhuǎn)錄,最終大量炎癥介質(zhì)TNF-α的大量合成與釋放,造成肝細(xì)胞的損傷[12~14]。

    本研究結(jié)果顯示,經(jīng)健脾清化飲治療后,中藥低、高劑量組大鼠肝組織炎癥及脂肪浸潤明顯好轉(zhuǎn),肝組織炎癥因子水平降低,且以中藥高劑量組療效更為顯著。NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中,TLR4/NF-κB/TNF-α信號通路持續(xù)激活,健脾清化飲可能是通過阻斷TLR4/NF-κB/TNF-α信號通路的持續(xù)激活從而達(dá)到治療作用,其具體的調(diào)控作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

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