牛初乳凍干粉及其產(chǎn)品中EGF·TGF—α和IGF—1的含量測定及其變化

王小軍 常萍 牛詩捷

摘要 [目的]研究牛初乳凍干粉（LBC）及其產(chǎn)品中表皮生長因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）和類胰島素生長因子-1（IGF-1）含量的變化。[方法]采用冷凍干燥工藝制備0～7 d的LBC和常乳凍干粉（LM），采用酶聯(lián)免疫分析法測定EGF、TGF-α和IGF-1的含量。[結(jié)果]2 d內(nèi)牛初乳凍干后平均干物質(zhì)含量為200 g/L。第1天LBC中EGF（7.0 ng/g）、TGF-α（16.8 ng/g）和IGF-1（3.36 μg/g）的含量最高，此后快速下降，第7天接近LM水平。第0～4天LBC中EGF、TGF-α和IGF-1的平均含量分別為5.6 ng/g、9.6 ng/g和2.42 μg/g，分別為LM的7.0倍、13.7倍和6.1倍。3種牛初乳保健食品的EGF和TGF-α含量顯著高于LM和2種市售奶粉。初乳素的EGF和TGF-α含量高于其他2種牛初乳保健食品。初乳素的IGF-1含量為1.11 μg/g，極顯著高于LM。[結(jié)論]研究可為牛初乳產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供理論和試驗依據(jù)。

關(guān)鍵詞 牛初乳凍干粉；牛初乳產(chǎn)品；表皮生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子-α；類胰島素生長因子-1；酶聯(lián)免疫分析法

中圖分類號 TS207.3 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）09-0096-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.09.028

Abstract [Objective] To study the changes of contents of epidermal growth factor（EGF）， transforming growth factorα（TGFα） and insulinlike growth factor1 （IGF1） in lyophilized bovine colostrums （LBC） during the lactation of 7 days and their contents in bovine colostrums products . [Method] Bovine colostrums from the first day to the 7th days postpartum and milk were prepared into LBC and LM by the freezedrying technology， and the contents of EGF， TGFα and IGF1 were analyzed by enzymelinked immunoassay. [Result] The average dry matter content of bovine colostrums within 2 days was 200 g/L by lyophilization. The highest content of EGF（7.0 ng/g）， TGFα（16.8 ng/g） and IGF1（3.36 μg/g） was found in the LBC of the first day postpartum， then rapidly decreased within 7 days， and the contents on the 7th day were close to LM levels. The average content of EGF， TGFα and IGF1 in LBC within 4 days were 5.6 ng/g， 9.6 ng/g， 2.42 μg/g， which were 7.0， 13.7 and 6.1 times as that in LM. The contents of EGF， TGFα in three bovine colostrums healthcare food （BCHF） were significantly higher than two market milk powder and LM. The contents of EGF， TGFα in prolactin were significantly higher than other two bovine colostrum health food. The content of IGF1 in prolactin was 1.11 μg/g， which was significantly higher than that in LM.[Conclusion] The research could provide theoretical and experimental basis for the further development and utilization of bovine colostrum products.

Key words Lyophilized bovine colostrums（LBC）；Bovine colostrums products；Epidermal growth factor（EGF）；Transforming growth factorα（TGFα）；Insulinlike growth factor1（IGF1）；Enzymelinked immunoassay

牛初乳是指奶牛分娩后7 d內(nèi)所分泌的乳汁，它不僅含有人體必需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)外，而且含有大量的生物活性物質(zhì)。研究表明，牛初乳中含有90多種的生物活性物質(zhì)，特別是初乳含有大量高濃度的生長因子，如TGF、EGF、IGF-1[1]等。牛初乳是除人初乳以外唯一富含生長因子和免疫因子的天然食物[2]，2000年被美國食品科技協(xié)會（IFT）列為21世紀最具發(fā)展前景的非草藥類天然健康食品。迄今為止，已有報道的除上述幾種生長因子外，還有神經(jīng)生長因子（NGF）、肝細胞生長因子（HGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）、紅細胞生成素（EPO）等[3-5]。這些生長因子的提取物作為健康產(chǎn)品，在傷口修復(fù)以及治療小腿潰瘍、牛皮癬、克羅恩氏病、腸道黏膜炎、骨質(zhì)疏松癥和在化療中的細胞保護等方面的應(yīng)用已有報道[4]。它們作為藥物和保健食品的功能因子受到廣泛的關(guān)注，已經(jīng)成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點。

目前，對牛初乳中一些生長因子研究主要集中在IGFs，關(guān)于TGF-α和EGF報道較少，所用研究樣品都是液態(tài)初乳，關(guān)于牛初乳加工成制劑或產(chǎn)品后的生長因子含量鮮見報道。筆者采用冷凍干燥技術(shù)制備0～7 d的牛初乳凍干粉，探討牛初乳凍干粉中IGF-1、TGF-α和EGF含量的變化規(guī)律，并比較幾種牛初乳產(chǎn)品中這些生長因子的含量，旨在為牛初乳產(chǎn)品的進一步開發(fā)利用提供理論和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集3頭奶牛分娩后0～7 d的牛初乳各500 mL，立即于-20 ℃下冷凍儲藏備用；常乳為市售純牛奶（100%純牛奶），購自南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司；乃捷爾牌初乳素膠囊[衛(wèi)食健字（1997）418號]簡稱初乳素，功效成分免疫球蛋白含量≥20%，生產(chǎn)批號為20160811，為江蘇天美健大自然生物工程有限責任公司產(chǎn)品；產(chǎn)品1（生產(chǎn)批號20160714）和產(chǎn)品2（生產(chǎn)批號20160916）均為市售的牛初乳類保健食品（功效成分免疫球蛋白含量在17%左右）；脫脂奶粉，購自內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；全脂奶粉，購自內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司；EGF和TGF-α的ELISA檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

GT1型冷凍干燥機，為德國SRK系統(tǒng)技術(shù)有限公司產(chǎn)品；智能型超速離心機，為美國貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司產(chǎn)品；Z36HK型高速冷凍離心機，為德國Hermle公司產(chǎn)品；EV300型紫外可見分光光度計，為美國Thermo fisher公司產(chǎn)品；RT-6000型酶標分析儀，為深圳雷杜生命科學股份有限公司產(chǎn)品；DK-8D電熱恒溫水浴箱，為上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1

牛初乳凍干粉（LBC）和常乳凍干粉（LM）的制備。牛初乳和常乳4 000 r/min冷凍離心10 min進行脫脂，脫脂乳于-80 ℃冰箱中凍結(jié)后，移至冷凍干燥機內(nèi)，在高真空度下進行冷凍干燥，加工成LBC和LM，分裝后-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2

IGF-1含量的測定。用生理鹽水將試驗樣品配制成150 mg/mL的溶液，用玻璃勻漿器勻漿，12 000 r/min 離心20 min（4 ℃），取上清液調(diào)節(jié)pH至4.6，攪拌30 min，離心除酪蛋白后得到乳清。將乳清pH調(diào)至6.4左右，10 000 r/min離心5 min，取上清液參照云振宇等[6]的方法（ELISA法）測定IGF-1的含量。

1.3.3 EGF和TGF-α含量的測定。將試驗樣品用生理鹽水配制成150 mg/mL的溶液，用玻璃勻漿器勻漿，15 000 r/min冷凍離心15 min[7]，取上清液用于EGF和TGF-α含量的測定。EGF和TGF-α含量的測定采用ELISA法，按照ELISA檢測試劑盒說明書進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用方差分析法進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果均以平均值±標準差表示，P< 0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 1～7 d牛初乳凍干粉的干物質(zhì)含量變化

從圖1可以看出，脫脂后牛初乳凍干后的干物質(zhì)含量隨泌乳時間的延長呈下降趨勢。第1天LBC的干物質(zhì)含量為256 g/L，第2天LBC的干物質(zhì)含量下降了約50%，第1～2天LBC的干物質(zhì)含量顯著高于第3～7天（P<0.05），其平均干物質(zhì)含量為200 g/L，與Blum等[3]報道相一致。第4天后LBC干物質(zhì)含量基本穩(wěn)定在90 g/ L左右。Dzik等[1]認為分娩后24～48 h的牛初乳是最寶貴的，產(chǎn)犢后時間與初乳質(zhì)量成正比，并且生物活性物質(zhì)在初乳中的含量隨著時間的推移而減少。該研究中LBC在2 d內(nèi)平均干物質(zhì)含量為200 g/L，遠高于第3～7天。這說明2 d內(nèi)的LBC含有更多的生物活性物質(zhì)，這與許多生長因子在分娩后幾天內(nèi)的牛初乳中的高含量相一致。

2.2 0～7 d牛初乳凍干粉中EGF、TGF-α和IGF-1含量的動態(tài)變化

從圖2可以看出，LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量在7 d泌乳期內(nèi)呈下降趨勢。EGF在第1天的LBC中含量最高（7.0 ng/g），在第2～4天EGF含量變化較小，第4天后快速降低。TGF-α含量在分娩后1 d為17.5 ng/g，高于0.5 d，在1.5 d時含量下降了33%，此后逐步下降，4.5 d后穩(wěn)定在2 ng/g左右。IGF-1含量變化與TGF-α相似，在0.5 d時含量最高（3 464 ng/g），4.5 d IGF-1含量迅速降至920 ng/g，第5～7天逐步下降，與文獻報道[8-9]基本一致。關(guān)于初乳中EGF和TGF-α的含量變化報道，目前僅見于豬初乳[10]和人初乳[11]EGF的報道，它們在分娩后0 h和1 d的EGF含量最高，在72 h和7 d內(nèi)呈明顯下降趨勢，牛初乳中EGF和TGF-α的研究也僅限于初乳和常乳中含量的比較[3-4 ]。乳中的生長因子（如IGFs、EGF、TGF和NGF等）通常在泌乳第1天含量最高，此后逐漸下降，最后達到常乳水平[12]。該試驗結(jié)果顯示，在LBC中的這3種生長因子在第1天的含量最高，在第3天仍保持較高含量，此后明顯下降，第7天接近常乳水平。加工后的LBC與液態(tài)牛初乳呈現(xiàn)相似的含量動態(tài)變化，說明合理的加工過程對這些生長因子的含量沒有明顯影響。同時，對于牛初乳中生長因子等生物活性成分的開發(fā)利用，選用3 d內(nèi)的牛初乳作為原料比較適宜。

2.3 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉中IGF-1、EGF和TGF-α含量的比較

EGF和TGF-α是表皮生長因子家族中最重要的2種生長因子。其中TGF-α是由50個氨基酸組成的多肽，與EGF在結(jié)構(gòu)上有30%～40%的同源性。EGF和TGF-α均可與其共同的受體EGFR結(jié)合，從而激活后者自身的酸蛋白激酶，促使DNA合成，從而引起細胞的增殖和分化等一系列反應(yīng)[12]。筆者測定了LBC中EGF和TGF-α的含量，結(jié)果見圖2。分娩后第1天LBC中EGF含量最高（7.0 ng/g），顯著高于2～7 d的LBC和LM（P<0.05）。第0～4天LBC中EGF平均含量為5.6 ng/g，是LM中含量的7倍，顯著高于5～7 d的LBC和LM（P<0.05）。第7天LBC中EGF含量為1.7 ng/g，已接近LM水平。已報道的動物中除嚙齒動物以外，人和其他哺乳動物的初乳中EGF含量明顯高于常乳[5，13-14]。該研究發(fā)現(xiàn)1～6 d LBC中EGF的含量顯著高于LM，特別是4 d以內(nèi)的LBC有較高含量的EGF。TGF是在牛初乳中發(fā)現(xiàn)的另一種生長因子，可分為α、β和γ型，目前TGF-β的相關(guān)報道較多，而關(guān)于TGF-α的研究報道很少[15]。筆者測定了LBC中TGF-α的含量，在0～7 d的LBC中，以分娩后0.5 d（16.2 ng/g）和1 d（17.5 ng/g）LBC中TGF-α 的含量最高，顯著高于其他天數(shù)。第0～4天的LBC含有較高含量的TGF-α，平均含量為9.59 ng/g，是LM（0.7 ng/g）的13.7倍，顯著高于5～7 d的LBC和LM。第4.5～7天LBC中TGF-α的含量在2 ng/g左右，其中第6.5天和第7天的TGF-α含量與LM相比無顯著差異。

IGF-1是牛初乳中含量最高和研究最深入的一種生長因子，不同研究報道的牛初乳IGF-1含量變化較大，濃度為50～2 000 ng/L[16]，但研究樣品都是液態(tài)牛初乳，對牛初乳制劑及其制品的IGF-1研究目前僅見Elfstrand等[15]對凍干初乳濃縮粉（5.0 μg/g）和凍干乳清粉（2.3 μg/g）中的含量報道。該研究發(fā)現(xiàn)第1天LBC中IGF-1的含量為3.4 μg/g，是LM的8.4倍，0～4 d LBC中IGF-1的平均含量都在μg/g 級水平，遠高于LM（0.4 μg/g），與Pakkanen等[16] 的報道較為接近。LBC中高含量的IGF-1為使用牛初乳制劑預(yù)防和治療糖尿病[17-18]等疾病奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

EGF是一種細胞分裂促進因子，能刺激體內(nèi)多種類型的組織細胞分裂和增殖，特別是初乳中的EGF可有效促進初生動物腸黏膜細胞的增殖與分化[13]，能影響胃腸道一系列酶的活性和腸道吸收功能[11]。TGF-α能夠促進人腸上皮細胞細胞的增殖且具有劑量依賴性，能促進人結(jié)腸上皮細胞RNA含量的增加和蛋白質(zhì)的合成[19]。TGF-α也可通過與表皮生長因子受體（EGFR）結(jié)合，從而對腸黏膜上皮起到調(diào)節(jié)保護和促進損傷恢復(fù)的作用[12]。IGF-1作為胃腸道的一種有效營養(yǎng)因子，能增加蛋白質(zhì)的代謝，促進腸黏膜細胞的增殖，維持腸道結(jié)構(gòu)的完整性[20]。該研究結(jié)果表明凍干后的牛初乳，特別是0～4 d LBC比LM有更高含量的EGF、TGF-α和IGF-1，提示LBC在預(yù)防和治療胃腸道疾病方面具有很好的應(yīng)用價值。

2.4 牛初乳產(chǎn)品及其乳制品中EGF、TGF-α 和IGF-1含量的比較

由表1可知，3種牛初乳保健食品中EGF和TGF-α的含量顯著高于LM和2種市售奶粉（P<0.05）。初乳素的EGF和TGF-α含量分別為5.58和11.84 ng/g，顯著高于2種牛初乳保健食品（P<0.05）。產(chǎn)品1的EGF含量顯著高于產(chǎn)品2（P<0.05）；產(chǎn)品1和產(chǎn)品2的TGF-α含量接近，二者無顯著差異。初乳素的EGF和TGF-α含量分別為LM的6.3倍和14.4倍，2種牛初乳產(chǎn)品也含有較高含量的TGF-α（約為LM的11倍）。初乳素是純牛初乳凍干粉產(chǎn)品，其IGF-1含量為（1.11±0.11）μg/g，極顯著高于LM（P<0.01）。Iacopetta 等[21]、孫瑤等[22]通過測定發(fā)現(xiàn)人乳中EGF的含量為30～40 ng/mL，遠高于牛奶和牛初乳，在幾種嬰兒配方奶粉中未檢測到EGF活性或含量較低（0.41～0.62 ng/mL）。 Xiao等[23]研究表明新鮮牛奶的EGF含量為13.8～18.2 nmol/L，與足月兒奶相當，配方奶的EGF濃度明顯低于人奶和新鮮牛奶。但將牛初乳加工成產(chǎn)品后，其EGF含量迄今未見報道。該研究結(jié)果表明，初乳素的EGF含量為5 ng/g，2種牛初乳保健食品的EGF含量為2～3 ng/g，遠高于LM和市售奶粉。由此可見，牛初乳產(chǎn)品比常乳及乳制品有更高的EGF含量。

不同的加工方式對牛初乳中生長因子的含量會產(chǎn)生影響，如羊乳在高溫短時巴氏殺菌（75 ℃15 s，85 ℃10 s）時其EGF濃度較為穩(wěn)定，保留率在90%以上，而在低溫長時巴氏殺菌（63 ℃30 min）和超高溫瞬時殺菌（137 ℃2 s）EGF濃度顯著降低[24]。EGF、TGF-α和IGF-1的分子量為6～7 ku，如采用超濾濃縮工藝會造成這些生長因子25%以上的損失[15]。初乳素是以奶牛分娩3 d以內(nèi)的初乳為原料，采用冷凍干燥工藝和冷殺菌技術(shù)加工而成，完全保留了牛初乳中的這些具有生理功能的生長因子。

免疫球蛋白是牛初乳產(chǎn)品的標志性成分，在第1天的牛初乳中含量最高，在7 d內(nèi)含量迅速下降，與該研究中測定的幾種生長因子在牛初乳中含量的動態(tài)變化基本一致，在牛初乳中免疫球蛋白G含量與一些生長因子水平的變化有相關(guān)性[3]。初乳素的免疫球蛋白含量≥20%，高于其他2種產(chǎn)品（17%左右），提示初乳素含有更為豐富的生長因子，這可能是初乳素中的生長因子含量高于其他牛初乳產(chǎn)品的原因之一。

3 結(jié)論

該研究首次報道了0～7 d牛初乳經(jīng)凍干后制成的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)，

在分娩0～7 d 的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1的含量呈下降趨勢，第7天的LBC已接近LM水平。48 h內(nèi)牛初乳凍干后平均干物質(zhì)含量為200 g/mL。

在0～7 d的LBC中這些生長因子含量變化較大，在第1天的LBC中EGF、TGF-α和IGF-1含量最高，分別為7.0 ng/g、16.8 ng/g和3.4 μg/g，第1～4天LBC中EGF的平均含量為LM的7.0倍，TGF-α平均含量是LM的13.7倍，IGF-1含量是LM的6.1倍，提示4 d以內(nèi)的牛初乳凍干粉有較高含量的生長因子，為牛初乳產(chǎn)品的進一步開發(fā)應(yīng)用提供了依據(jù)。

3種市售牛初乳保健食品中的EGF和TGF-α含量顯著高于LM和2種市售奶粉，初乳素的EGF和TGF-α含量分別為5.6和11.8 ng/g，顯著高于其他2種牛初乳保健食品。初乳素的IGF-1含量達到μg/g級水平。

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