田旋花EPSPS基因表達特征及草甘膦對其表達的影響

黃兆峰 白薇薇 周欣欣 黃紅娟 姜翠蘭 張朝賢 魏守輝

摘要 采用實時熒光定量RT-PCR測定了田旋花不同組織、不同葉齡的EPSPS基因mRNA的相對表達量以及草甘膦對EPSPS基因相對表達量的影響。結果表明：田旋花EPSPS基因在不同組織表達量差異顯著，在葉的表達量高于莖和根;該基因在9葉期的表達量最高，是3葉期的1.5倍;在草甘膦處理后，田旋花EPSPS基因的表達量先升高后降低，在處理后24 h達最大值。隨草甘膦劑量增加，該基因的表達量升高。研究結果可為深入解析田旋花對草甘膦耐藥性機理提供參考。

關鍵詞 田旋花; 草甘膦; EPSPS; 表達

中圖分類號： S 482.4， S 451.2

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018372

5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS， EC 2.5.1.19）是莽草酸途徑中的關鍵酶，莽草酸-3-磷酸（S3P）和烯醇式丙酮酸（PEP）在EPSPS的催化下轉化為5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸（EPSP）[1]。草甘膦是目前應用最為廣泛的廣譜滅生性、內吸傳導型除草劑[2]。它的作用方式是抑制EPSPS活性，阻斷芳香族氨基酸如色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的生物合成，從而達到除草的目的[3]。由于草甘膦具有高效、低毒、低殘留、無污染等優(yōu)良特性，使其迅速成為耐除草劑轉基因作物的首選藥劑。隨著耐草甘膦轉基因作物的大面積種植和草甘膦的廣泛使用，抗/耐草甘膦雜草將不斷發(fā)生與發(fā)展，給農(nóng)田雜草治理帶來嚴峻挑戰(zhàn)[45]。到目前為止，全球已有42種雜草對草甘膦產(chǎn)生了抗藥性[6]。

雜草對草甘膦的抗藥性可以分為靶標抗性和非靶標抗性兩方面[7]。其中，靶標EPSPS突變或過表達導致的抗藥性占主要部分。

靶標EPSPS突變。草甘膦靶標EPSPS基因關鍵部位核苷酸被取代，導致氨基酸類型改變，進而引起EPSPS構象發(fā)生變化，致使草甘膦與EPSPS結合能力下降，最終導致藥效降低[89]。牛筋草Eleusine indica、多花黑麥草Lolium multiflorum的EPSPS 106位氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Pro-106-Ser）或蘇氨酸（Pro-106-Thr），導致對草甘膦抗藥性[1011]。抗草甘膦牛筋草種群EPSPS同時存在102位（Thr-102-Ile）和106位（Pro-106-Thr）兩個氨基酸取代，該種群表現(xiàn)出對草甘膦高抗性[1213]。

EPSPS過表達。EPSPS 基因拷貝數(shù)增加，過表達的EPSPS提供了充足的酶來滿足正常生長發(fā)育的需要，從而表現(xiàn)出對草甘膦抗藥性[1415]。長芒莧Amaranthus palmeri、意大利黑麥草Lolium perenne ssp.multiflorum、地膚Kochia scoparia等雜草的EPSPS基因在多個染色體上成倍擴增， 這些雜草抗藥性均是由于靶標EPSPS過表達導致[1517]。耐草甘膦的狗肝菜Dicliptera chinensis和麥冬Ophiopogon japonicus經(jīng)草甘膦處理后，EPSPS在轉錄水平上提高，過表達的EPSPS解除了草甘膦的限制，增加了對草甘膦的耐藥性[1819]。

田旋花Convolvulus arvensis L.屬旋花科旋花屬雜草，該雜草具有龐大的根系，以地下根芽或種子進行繁殖，生命力極強，防除困難[20]。已被聯(lián)合國糧農(nóng)組織列為世界上18種危害最嚴重的雜草之一。同時，田旋花是最早報道的對草甘膦具有天然耐藥性的雜草之一[21]，但其耐藥性機制至今尚不明確。前期的研究發(fā)現(xiàn)田旋花EPSPS并無關鍵氨基酸位點突變[22]，由于EPSPS過表達是草甘膦抗/耐藥性的重要機理之一，為探究EPSPS過表達是否在耐草甘膦田旋花中存在，本試驗以田旋花為試材，比較了不同組織EPSPS基因表達差異，分析了不同葉齡田旋花EPSPS基因mRNA相對表達量以及草甘膦對EPSPS基因表達的影響，以期為闡明田旋花對草甘膦耐藥性機理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

田旋花種子采自北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)（116°17′E;40°13′N）。種子經(jīng)80%硫酸浸泡30 min，洗凈后清水浸泡24 h，于恒溫箱中28℃催芽12 h。選萌發(fā)長勢相同的種子，每個花盆（8 cm ×10 cm）中播種6粒，置于溫室內培養(yǎng)（25℃/22℃，相對濕度40%，光照12 h）。待出苗后2葉期進行間苗，每盆保留4株長勢一致的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。研究EPSPS組織表達差異時，在田旋花子葉完全展開后取子葉樣品，在田旋花6葉期時取根、莖和葉（植株頂部第1～3片葉）樣品;研究田旋花不同葉齡EPSPS表達差異時，取植株頂部第1～3片葉;研究草甘膦對EPSPS表達影響時， 將田旋花幼苗培養(yǎng)至6葉期，用不同劑量的草甘膦461.25、922.5、1 845 g/hm2進行莖葉噴霧處理，分別在處理后12、24、36和48 h取樣，取植株頂部第1～3片葉（約200 mg），取樣后用液氮迅速冷凍，放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個樣品或處理設生物學重復3次。

1.2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）登錄的田旋花EPSPS （EU698030）和18S rRNA（AJ236013.1）基因序列設計兩對特異性引物EPSPS-f 和EPSPS-r及18S rRNA-f和18S rRNA-r（表1）。上述引物由北京六合華大公司合成。

1.3 田旋花總RNA提取及cDNA的合成

按照離心柱式植物總RNA提取試劑盒（天根生化科技公司）的說明提取田旋花不同組織及草甘膦處理后葉片的總RNA。凝膠電泳檢測合格后，用于cDNA的合成。以總RNA為模板，用RT-PCR試劑盒（TaKaRa）反轉錄得到cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量PCR分析EPSPS表達

采用ABI7500 實時定量 PCR 儀，以cDNA 為模板，按照SYBR Green PCR Master Mix使用說明進行PCR擴增。反應體系為：12.5 μL 2 ×SYBR Green，1 μL cDNA，0.5 μL引物，補水至總體積25 μL。反應程序為：95℃ 15 s，62℃ 25 s，30個循環(huán)。反應結束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。Ct值取平均值。以ΔΔCt 法來計算EPSPS的表達量。18S rRNA在不同組織及草甘膦處理后表達穩(wěn)定，故該基因被選作內參基因[22]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 田旋花不同組織EPSPS基因表達特征

以田旋花根、莖、葉和子葉為試驗材料，測定了EPSPS基因在不同組織的表達特征。如圖1所示，EPSPS基因在田旋花不同組織中表達量差異顯著。在葉中表達量最高，顯著高于在其他組織中的表達量，其次是莖和子葉，在根中的表達量最低。EPSPS基因在莖和子葉中的表達量與在根中的表達量差異也達顯著水平。

2.2 EPSPS基因在田旋花不同葉齡表達特征

田旋花在不同葉齡分別取頂部第1～3片葉用于EPSPS基因表達量檢測。結果如圖2所示，田旋花EPSPS基因在3、6、9、12葉期表達量有差異。在9葉期的相對表達量最高，是表達量最低的3葉期的1.5倍，EPSPS基因在田旋花9葉期和12葉期的表達量差異不顯著。

2.3 草甘膦處理對田旋花EPSPS基因表達的影響

以不同劑量草甘膦處理過的田旋花葉片（6葉期時頂部第1～3片葉）為試材，利用實時熒光定量PCR分析了草甘膦對EPSPS基因表達的影響。結果顯示，田旋花EPSPS基因在草甘膦（922.5 g/hm2）處理后呈先升高后降低的趨勢，在處理后24 h時表達量達到最高，約為未處理時的12倍，之后逐漸下降（圖3）。隨著草甘膦劑量的提高，田旋花EPSPS基因表達呈增加趨勢。

3 討論

目前，化學除草仍是世界各國防控雜草的主要方式之一。過度依賴化學除草不但造成抗藥性雜草的發(fā)生和發(fā)展，而且會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負面影響。在倡導農(nóng)藥減量、環(huán)境保護和綠色發(fā)展的背景下，如何防控抗藥性雜草的發(fā)生和發(fā)展是當前雜草科學研究的重要內容。而闡明雜草對除草劑抗藥性的內在機制，尤其是解析雜草對世界第一大除草劑草甘膦的抗/耐藥性機制是雜草抗藥性研究的首要任務。

為闡明田旋花對草甘膦的天然耐藥性機制，作者在前人研究的基礎上推測田旋花對草甘膦耐藥性可能與靶標EPSPS基因過表達相關。植物不同器官對芳香族氨基酸的需求是不同的，而芳香族氨基酸是莽草酸途徑中的產(chǎn)物，EPSPS酶是莽草酸途徑中的關鍵酶，因此EPSPS基因在不同組織器官中的表達量可能不一致[23]。本研究利用熒光定量方法對田旋花EPSPS基因在不同組織中的表達模式進行了分析。結果表明，EPSPS基因在田旋花根、莖、葉和子葉均有表達，說明EPSPS基因的表達不具有組織特異性。這一結果與在薤白[24]中EPSPS的表達相一致。田旋花EPSPS基因在葉中表達量最高，在陸地棉[23]中也得到了同樣的結果。

在外界因子脅迫下，植物體感受外界脅迫信號而啟動或關閉某些基因的表達，以抵御逆境的危害，保證植物細胞的正常生理功能和植物體生長發(fā)育。研究表明：植物體內EPSPS基因的過量表達可以提高對草甘膦的耐受性[1517]。棉花品系Y18在受到草甘膦的脅迫作用時，植物體內的EPSPS酶表達量呈現(xiàn)增加的趨勢[25]。Shyr等[26] 發(fā)現(xiàn)，胡蘿卜在含有草甘膦的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，EPSPS基因的轉錄水平明顯增加。此外在狗肝菜和麥冬等雜草中均發(fā)現(xiàn)了草甘膦處理導致EPSPS基因表達上調的現(xiàn)象[1819]。但是，長芒莧的EPSPS基因表達不受草甘膦處理的影響[15]。本研究表明：草甘膦處理可以引起田旋花EPSPS表達量的提高，并且隨著草甘膦劑量的增加，EPSPS表達量也升高，這可能是田旋花對草甘膦耐藥性的分子機制。

基因的表達調控受啟動子和轉錄因子調節(jié)。田旋花在草甘膦處理后，EPSPS基因上調表達可能與啟動子順式作用元件或相關轉錄因子有關。從EPSPS基因啟動子和轉錄因子入手探究田旋花耐草甘膦更深層次的機理將是下一步研究重點。

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（責任編輯：田 喆）