黑豆納豆激酶凍干保護(hù)劑的選擇

韓翠萍 劉慶冠 劉 暢 張 涵 江連洲 程建軍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

納豆起源于日本，是深受日本人民喜愛的傳統(tǒng)發(fā)酵食品，迄今已有2000 多年的歷史[1]，與中國的豆豉有很深的歷史淵源[2]。納豆激酶是納豆在發(fā)酵過程中由納豆枯草桿菌（納豆菌）產(chǎn)生的一種堿性絲氨酸蛋白酶[3]，具有溶解血栓，促進(jìn)血液循環(huán)以及預(yù)防心血管疾病等醫(yī)療保健功能[4]。目前國內(nèi)外對納豆激酶的研究主要集中在其藥理作用和分離純化上，而對其凍干保護(hù)劑的研究鮮有報道。Cai Yongjun 等[5]研究表明，可用DNA 家族改組技術(shù)提高納豆激酶的纖溶活性，為納豆激酶在溶栓治療中的應(yīng)用提供有益的參考。Fujita M 等[6]和Sumi H[7]發(fā)現(xiàn)納豆激酶具有將pro -UK（尿激酶原）激活成尿激酶的活性。Lampe 等[8]研究表明，納豆激酶擁有比傳統(tǒng)的溶栓劑更為卓越的優(yōu)點，如無抗原性，半衰期較長，不易引起出血等。張新[9]和閻家麒等[10]成功將發(fā)酵液先用硫酸銨鹽析沉淀，再經(jīng)超濾除去金屬離子，然后分別使用Sephadex G-100 層析柱和Sephacry1 S-200 層析柱純化。此分離純化方法將幾種提酶法融合在一起，取長補(bǔ)短，得到的酶活性也較高。韓潤林等[11]采用發(fā)酵與泡載分離耦合方法研究納豆激酶的分離純化，結(jié)果表明，該法使生產(chǎn)周期大幅度的縮短，更重要的是提高了酶的活性。YANG 等[12]研究采用超順磁性聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微球從發(fā)酵液中直接分離純化納豆激酶，試驗結(jié)果較為理想，酶活回收率85%，純化因子8.7%。

細(xì)胞和組織在凍干過程中會受到不同程度的損傷，包括機(jī)械損傷、細(xì)胞膜損傷以及細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)功能的損傷，更嚴(yán)重的會導(dǎo)致細(xì)胞或組織死亡[13]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，加入凍干保護(hù)劑可以降低凍干過程對細(xì)胞組織的損傷程度，盡可能保持其原有的組織結(jié)構(gòu)和生物活性[14]。凍干保護(hù)劑能將細(xì)胞和菌體最大面積地包裹在其中，減少細(xì)胞組織和菌體與氧氣間接或直接接觸，為細(xì)胞提供一個良好的休眠環(huán)境，因此能夠達(dá)到延長物料的儲存期，使物料在一定時間內(nèi)保持較高活性的效果[15]。

在添加殼聚糖的條件下，本文首先考察8 種凍干保護(hù)劑對納豆激酶在凍干過程中的保護(hù)效果，然后做正交試驗，以納豆激酶酶活和納豆菌存活率為指標(biāo)，最終確定最佳的復(fù)合凍干保護(hù)劑組合，以期為納豆激酶凍干保護(hù)劑的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

納豆激酶，東北農(nóng)學(xué)大學(xué)實驗室自提；尿激酶，中國藥物生物制品檢定所；納豆芽孢桿菌，上海惠世生化試劑有限公司；牛血纖維蛋白原，上海源葉生物科技有限公司；瓊脂糖（生化試劑），上海萬疆生物技術(shù)有限公司；其它藥品和試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

NH-4 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州賽普實驗儀器廠；ARRW60 型電子精密天平（精密度為0.01g），奧豪斯（上海）公司；可調(diào)移液器，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司；數(shù)字酸度計，上海大普儀器有限公司；DHP-9012 型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；電子數(shù)顯卡尺，無錫凱保鼎工具有限公司；LGJ-1 冷凍干燥機(jī)，上海醫(yī)用離心機(jī)廠；SHA-13 恒溫振蕩器，常州國華電器有限公司；XH-C 旋渦混合器，常州恩培儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆激酶酶活保持率的測定 采用瓊脂糖-纖維蛋白平板法來測定納豆激酶的活性。

1） 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立纖維蛋白平板的溶解圈面積與尿激酶活力單位的相關(guān)性。用磷酸鹽緩沖液將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至250，500，1 000，1 500，2 000 IU/mL，用移液槍分別取10 μL 溶液點樣于纖維蛋白平板上，測定溶解圈兩個相互垂直的直徑，相乘作為溶解圈面積，測定3 次。將3 組數(shù)值取平均值，以尿激酶酶活為縱坐標(biāo)，溶解圈面積為橫坐標(biāo)，繪制酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2） 纖維蛋白平板制作 參照Astrup[16]報道的方法，略加調(diào)整，制作纖維蛋白平板。

納豆激酶酶活保持率計算公式：

1.3.2 納豆菌存活率的測定 納豆菌是日本傳統(tǒng)發(fā)酵食品——納豆的生產(chǎn)菌，該菌可以產(chǎn)生一系列抗菌肽類物質(zhì)（通常有surfactin、iturin、fengycin等）[17]，能夠有效抑制食品腐敗[18]。對納豆菌存活率的測定方法采用稀釋平板計數(shù)法，每組3 次試驗，結(jié)果取平均值，方法詳見參考文獻(xiàn)[19]。納豆菌存活率計算公式：

式中，B——凍干后的總菌群；A——凍干前的總菌群。

1.3.3 冷凍干燥保護(hù)劑的選擇和優(yōu)化 將脫脂乳粉、蔗糖、麥芽糊精、麥芽糖、乳糖、海藻糖、山梨醇等保護(hù)劑添加到 （添加量為4%，8%，12%，16%，20%）納豆激酶原液中，抗壞血酸（添加量為0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2%）添加到納豆激酶原液中，用無菌玻璃棒輕輕攪拌均勻后調(diào)節(jié)pH7.0～7.2，分裝于培養(yǎng)皿中，厚度約10 mm，先于冰箱中預(yù)冷凍10 h，而后冷凍干燥處理。干燥后，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。分別測定納豆激酶酶活保持率和納豆菌存活率。通過此方法先篩選出對納豆激酶和納豆菌保護(hù)效果較好的單一保護(hù)劑。在單因素試驗基礎(chǔ)上，對篩選出的保護(hù)劑復(fù)配處理后做正交試驗，對保護(hù)劑的組合進(jìn)行優(yōu)化。

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過Origin7.5、Design -Expert8.0 和SPSS Statistics20.0 分析所得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂乳粉對納豆激酶酶活保持率和納豆菌存活率的影響

以不同濃度的脫脂乳粉作為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，脫脂乳粉在冷凍干燥過程中對納豆菌和納豆激酶的保護(hù)作用比較顯著。當(dāng)脫脂乳粉的添加量為4%～8%時，納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率急劇增大，然后隨著添加量的增加緩慢增大，最后趨于穩(wěn)定。在脫脂乳粉的添加量16%時，兩者均達(dá)到最大值。

脫脂乳粉對納豆菌和納豆激酶的保護(hù)作用較明顯，是由于添加了脫脂乳粉后，使其大范圍的覆蓋在酶和菌體的表面，形成一層天然保護(hù)膜，較大程度地減少了納豆菌和納豆激酶暴露在空氣中的面積，進(jìn)而降低它們與氧氣發(fā)生反應(yīng)及蛋白質(zhì)變性的幾率。另外，脫脂乳粉還有防止細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)在凍干過程中遭到破壞而導(dǎo)致活性物質(zhì)流失的作用，提升了納豆菌的存活率。

經(jīng)綜合考慮，選取8%，12%，16% 3 個水平做下一階段的正交試驗。

2.2 蔗糖對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率的影響

以不同濃度的蔗糖作為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果如圖2所示。納豆菌和納豆激酶在蔗糖的存在下，得到較好的保護(hù)。在蔗糖添加量4%～12%時，納豆激酶酶活保持率顯著提高。從統(tǒng)計數(shù)據(jù)看，當(dāng)蔗糖添加量為12%時，納豆激酶的酶活保持率達(dá)到38.4%，隨著蔗糖添加量的增加，酶活保持率開始下降。對于納豆菌，在蔗糖添加量為8%時，納豆菌存活率便達(dá)到最大值44.6%，之后緩慢降低。

蔗糖是由一分子葡萄糖和一分子果糖脫水縮合而成的二糖，是一類低分子的糖類。在脫水縮合過程中醛基和酮基均遭到破壞，只剩分子內(nèi)的羥基與納豆菌和納豆激酶表面存在的自由基發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)行交聯(lián)作用，生成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，降低納豆激酶和納豆菌暴露在空氣中發(fā)生氧化反應(yīng)的程度，蔗糖的保護(hù)作用不如脫脂乳粉顯著。此外，蔗糖持水性較好，在溶液中可與水分子發(fā)生自由結(jié)合，減少了凍干過程中因水分的揮發(fā)而對納豆激酶和納豆菌有影響。

經(jīng)綜合考慮，選取8%，12%，16% 3 個水平進(jìn)行下一階段的正交試驗。

圖1 不同濃度的脫脂乳粉對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.1 Effect of different concentrations of defatted milk powder on NK and bacillus natto

圖2 不同濃度的蔗糖對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.2 Effect of different concentrations of sucrose on NK and bacillus natto

2.3 麥芽糊精對納豆激酶酶活保持率和納豆菌存活率的影響

以不同濃度的麥芽糊精作為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果見圖3所示。麥芽糊精對納豆菌和納豆激酶也有一定的保護(hù)作用。隨著麥芽糊精添加量的增加，納豆菌存活率和酶活保持率在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)較大幅度的提升，在麥芽糊精添加量分別為8%和12%時，納豆激酶酶活保持率和納豆菌存活率出現(xiàn)最大值，分別為21.9%和22.5%。繼續(xù)增加濃度，反而使酶活保持率和納豆菌存活率下降。

麥芽糊精是廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域中的一類凍干保護(hù)劑。當(dāng)它溶于溶劑后，會吸收溶劑中大量的熱量，使溶劑溫度驟然降低，防止蛋白質(zhì)被酶解、氧化；同時，它可降低溶液的冰點，抑制水結(jié)晶，較好地保護(hù)酶和菌體。

經(jīng)綜合考慮，選取4%，8%，12% 3 個水平進(jìn)行下一階段的正交試驗。

2.4 麥芽糖對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率的影響

以不同濃度的麥芽糖為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果見圖4。酶活保持率隨著麥芽糖添加量的增加先急劇增加再急劇下降，然后趨于穩(wěn)定，在添加量為8%時達(dá)到最大值14.9%；納豆菌存活率隨添加量的增加先顯著升高后緩慢降低，在添加量為12%時達(dá)到最大值17.2%。雖然在一定范圍內(nèi)，隨著麥芽糖添加量的增加，酶活保持率和納豆菌存活率均出現(xiàn)較大幅度的提升，但其最大值都不理想（＜20%），這主要是因為麥芽糖是一種還原糖，它的醛基在一定條件下與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)，導(dǎo)致酶和菌體受損，從而影響酶活和菌體存活率。本試驗不考慮將麥芽糖作為凍干保護(hù)劑。

圖3 不同濃度的麥芽糊精對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.3 Effect of different concentrations of maltodextrin on NK and bacillus natto

圖4 不同濃度的麥芽糖對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.4 Effect of different concentrations of maltose on NK and bacillus natto

2.5 抗壞血酸對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率的影響

以不同濃度添加量的抗壞血酸作為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果見圖5所示?？箟难釋{豆激酶和納豆菌的保護(hù)作用極其顯著。在添加量為0.4%時，酶活保持率和納豆菌存活率分別達(dá)到40.2%和51.2%。隨著抗壞血酸添加量的增加，酶活保持率和存活率急速增加，當(dāng)添加量1.2%時，酶活保持率和納豆菌存活率均達(dá)到最大值，分別為50.2%和62.1%。繼續(xù)增加抗壞血酸的濃度，酶活保持率和菌存活率趨于穩(wěn)定，最終選取0.4%，0.8%，1.2% 3 個水平進(jìn)行下一階段的正交試驗?？箟难崾且活愝^常見的抗氧化劑，在納豆激酶的冷凍干燥過程中，它可清除酶和菌體內(nèi)的自由基，進(jìn)而抑制蛋白質(zhì)氧化，提高菌體細(xì)胞的活性。

2.6 乳糖對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌存活率的影響

以不同濃度的乳糖為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率，結(jié)果見圖6。乳糖對納豆菌和納豆激酶的保護(hù)作用并不理想，添加量4%～12%之間酶活保持率和存活率有明顯的提升，然而其最優(yōu)值很低，分別為14.6%和16.7%。其原因可能與麥芽糖相似，它的醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生非酶褐變反應(yīng)，導(dǎo)致酶和菌體變性，影響蛋白質(zhì)的生理活性和功能特性，從而影響酶活和菌體存活率。從保護(hù)效果角度考慮，不選擇乳糖作為納豆激酶的凍干保護(hù)劑。

圖5 不同濃度的抗壞血酸對納豆激酶和納豆菌的影響Fig 5 Effect of different concentrations of ascorbic acid on NK and bacillus natto

圖6 不同濃度的乳糖對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.6 Effect of different concentrations of lactose on NK and bacillus natto

2.7 海藻糖對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌的存活率的影響

以不同濃度的海藻糖為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌存活率，結(jié)果見圖7。海藻糖對納豆激酶酶活保持率影響較大，當(dāng)添加量為8%時，可使酶活保持率達(dá)42.2%。隨著添加量的增加，酶活保持率緩慢增加，添加量為16%和20%時，數(shù)值基本處于平穩(wěn)狀態(tài)。海藻糖是一類非還原性雙糖，它使酶蛋白分子的失水部位通過氫鍵與外部游離的水分子相連接，增加了酶蛋白的穩(wěn)定性，降低了蛋白分子因構(gòu)象改變而變性的幾率。

然而，海藻糖對納豆菌的保護(hù)作用卻不理想，最優(yōu)值僅為29.1%，價格較其它凍干保護(hù)劑高，故不選擇海藻糖作為納豆激酶的凍干保護(hù)劑。

2.8 山梨醇對納豆激酶的酶活保持率和納豆菌存活率的影響

以不同濃度的山梨醇作為凍干保護(hù)劑，凍干后測定納豆激酶的酶活保持率和納豆菌存活率，結(jié)果見圖8。山梨醇對納豆菌和納豆激酶的保護(hù)作用相差甚遠(yuǎn)，添加量4%～12%之間，納豆菌存活率顯著增加，而酶活保持率基本不變；在添加量8%時達(dá)到最大值12.5%。山梨醇可以利用自身的結(jié)構(gòu)與納豆菌菌體表面的細(xì)胞膜相互結(jié)合，起到保護(hù)菌體細(xì)胞膜的作用，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。此外，山梨醇暴露在空氣中極易吸水，在一定程度上影響了凍干粉的儲存穩(wěn)定性，因此，不選擇山梨醇作為納豆激酶的凍干保護(hù)劑。

圖7 不同濃度的海藻糖對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.7 Effect of different concentrations of trehalose on NK and bacillus natto

圖8 不同濃度的山梨醇對納豆激酶和納豆菌的影響Fig.8 Effect of different concentrations of sorbitol on NK and bacillus natto

2.9 正交試驗優(yōu)化納豆激酶凍干保護(hù)劑

選取脫脂乳粉、蔗糖、麥芽糊精和抗壞血酸4種凍干保護(hù)劑進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗，共9 組試驗，每組做3 次平行試驗，進(jìn)一步優(yōu)化其凍干參數(shù)。試驗設(shè)計及結(jié)果見表1。

對于納豆激酶的酶活保持率，各因素對試驗的影響顯著性順序為A（脫脂乳粉）＞D（抗壞血酸）＞C（麥芽糊精）＞B（蔗糖），最佳方案為A3B2C2D3；而對于納豆激酶的納豆菌存活率，各因素對試驗的影響顯著性順序為A（脫脂乳粉）＞D（抗壞血酸）＞B（蔗糖）＞C（麥芽糊精），最佳方案為A3B1C3D3。

這兩個最優(yōu)方案并不完全相同，脫脂乳粉和抗壞血酸的添加量對于酶活保持率和納豆菌存活率都是最重要的影響因素，兩者先后順序也一致，且均選擇第3 水平為試驗的最佳水平。蔗糖和麥芽糊精對試驗的影響是次要因素。結(jié)合實際需求，選取A3B1C2D3作為最佳凍干保護(hù)劑組合，即：脫脂乳粉添加量16%，抗壞血酸添加量1.2%，麥芽糊精添加量8%，蔗糖添加量8%。

通過驗證，在此條件下凍干的納豆激酶酶活保持率為79.8%，納豆菌存活率為83.2%，較單一保護(hù)劑有較大提升，這是因為各種保護(hù)劑間存在協(xié)同作用，使凍干效果顯著提高。

表1 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 1 The design and results of orthogonal experiment

3 結(jié)論

從8 種凍干保護(hù)劑中選出對納豆激酶和納豆菌保護(hù)效果較好的，做正交試驗。通過極差分析并結(jié)合實際，確定最佳的凍干保護(hù)劑組合，即：脫脂乳粉添加量16%，抗壞血酸添加量1.2%，麥芽糊精添加量為8%，蔗糖添加量8%。通過驗證，在此條件下凍干的納豆激酶酶活保持率為79.8%，納豆菌存活率為83.2%，較單一保護(hù)劑有較大提升，凍干效果顯著提高。