邵武煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化與煙草青枯病發(fā)生關(guān)系初報

陳乾錦，林書震，李紅麗，李小龍，蘆阿虔，沈建平，郭夏麗，王巖*

1 南平市煙草公司光澤分公司，福建杭川光明大道中路64號 354100；

2 鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州科學(xué)大道100號 450000；

3 南平市煙草公司邵武分公司，福建邵武閩星花園煙草辦公大樓 354000

青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細菌性枯萎病，是多種農(nóng)作物產(chǎn)量損失的重要原因[1]。煙草青枯病在我國東部和南部煙區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，每年有大面積煙田遭到青枯病感染[2]。以往的研究著重于土壤理化性質(zhì)、微生物數(shù)量的變化以及各種防治措施對煙草青枯病的影響，較少關(guān)注煙田土壤中微生物群落的變化[3-4]。了解土壤微生物與作物種植之間的相互作用有助于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。一方面，土壤中的病原菌突破植物防御機制并引起疾?。涣硪环矫?，土壤微生 物在促進植物生長健康和保護植物免受疾病侵害方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，健康土壤中微生物的種類和多樣性不同于感染過細菌枯萎病的土壤[7]，這是因為植物缺乏對大多數(shù)病原體的遺傳抗性，植物通過根部分泌物吸引土壤微生物的拮抗成員，以抵御土壤中病原體和其他害蟲的侵害[8]。

邵武是福建省重要的植煙區(qū)，該地區(qū)受煙草青枯病危害嚴(yán)重。本試驗利用土壤微生物基因測序技術(shù)，比較健康煙田（未發(fā)病或者零星發(fā)?。┖桶l(fā)病煙田（發(fā)病率高于20%）之間土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化，分析微生物與煙草青枯病之間的關(guān)系，對于提高煙田土壤健康和防治煙草青枯病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地點位于福建省邵武市。該地區(qū)氣候溫暖濕潤，光照充足，常年平均降雨量1800mm左右，年平均氣溫18℃。試驗地點海拔200m～250 m。試驗煙田土壤類型為砂質(zhì)壤土，均為酸性土壤。供試烤煙品種為K326，試驗地前茬作物均為水稻。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年2～7月在以下4個試驗區(qū)同時進行，分別為三都（N27°23′ E117°34′，250 m）、芹田（N27°18′E117°27′，198 m）、沿山（N27°29′ E117°36′，232 m）和洋坑（N27°10′ E117°32′，213 m）。根據(jù)邵武市煙草公司提供的歷年青枯病發(fā)生數(shù)據(jù)，每個試驗區(qū)選取一塊往年發(fā)病率均超過20%的煙田作為發(fā)病試驗田，并在發(fā)病試驗田就近選擇一塊往年未發(fā)病或者零星發(fā)病煙田作為健康試驗田。4個試驗區(qū)地勢、土壤質(zhì)地和農(nóng)業(yè)管理措施均相同。分別在煙株移栽前、旺長期（移栽后50 d）和發(fā)病期（移栽后90 d）采集根部土壤，進行16S rRNA和18S rRNA基因測序。

1.3 測定內(nèi)容及方法

1.3.1 土樣采集

采用S型五點取樣法采取煙株根部土壤。健康煙田均采取健康煙株根部土壤，4個健康試驗田在2017年發(fā)病率分別為1.99%、4.72%、4.39%、7.47%（發(fā)病期取樣時調(diào)查所得，下同）。發(fā)病煙田在煙株發(fā)病前取普通煙株根部土壤，6月2日采集發(fā)病煙田土壤時，正值煙株生長進入成熟初期并有大量煙株出現(xiàn)青枯病癥狀（此時病株莖基部黑色條斑平均約10～20 cm），4個發(fā)病試驗田在2017年發(fā)病率分別為84.78%、78.90%、66.84%、67.16%。采集土樣時盡量選取發(fā)病程度相似的5株以上病株取其根部土壤。首先去除煙株根部表層土壤，以煙株莖部為中心直徑10 cm左右、深10 cm左右處的土壤進行取樣。取樣后用密封袋低溫封存，部分送往實驗室在4℃下冷藏以待微生物數(shù)量測定，部分用15 ml離心管裝滿立即送往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司對微生物進行基因測序。

1.3.2 土壤微生物定量測定

采用稀釋平板法[9]測土壤微生物數(shù)量。細菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基、真菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.3.3 土壤微生物基因測序

DNA抽提和PCR擴增：根據(jù)E.Z.N.A.? soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠泳檢測DNA提取質(zhì)量；細菌16S用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增；真菌18S用SSU081F（5’-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3’）和1196R（5’-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3’）引物對V5-V7可變區(qū)進行PCR擴增。

Illumina Miseq 測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用 QuantiFluor?-ST（Promega,USA）進行檢測定 量。根 據(jù) Illumina MiSeq 平 臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建文庫，16S為PE 2*300文庫，18S為PE2*250文庫。用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫。

數(shù)據(jù)處理：原始測序序列使用Trimmomatic 軟件質(zhì)控，使用FLASH軟件進行拼接，采用的UPARSE軟件（version 7.1 http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU（operational taxonomicunit）聚類；應(yīng)用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier （http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對閾值為70%。

1.4 數(shù)據(jù)計算與統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對微生物數(shù)量進行計算分析和統(tǒng)計，測序數(shù)據(jù)在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的I-Sanger生物信息分析云平臺進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物數(shù)量分析

不同時期煙田土壤微生物的數(shù)量如表1所示。健康和發(fā)病煙田土壤中細菌、放線菌的數(shù)量均隨煙株生長呈現(xiàn)出先增多后減少的趨勢，真菌則是先減少后增多。各生長期發(fā)病煙田土壤的細菌、放線菌和真菌數(shù)量均高于健康煙田。細菌數(shù)量在煙株生長過程中變化明顯，旺長期數(shù)量是移栽前的4.49倍，而在健康與發(fā)病煙田之間未出現(xiàn)顯著差異。放線菌數(shù)量的變化較小，在各生長期、健康與發(fā)病煙田之間均無顯著差異。真菌數(shù)量變化在煙株生長過程中存在顯著差異，旺長期其數(shù)量比移栽前減少了57%左右，在發(fā)病期數(shù)量又有所增長。移栽前真菌數(shù)量在健康和發(fā)病煙田土壤之間存在顯著差異，在發(fā)病煙田中數(shù)量較多，隨后在旺長期和發(fā)病期數(shù)量差異減小。

表1 不同時期煙田土壤微生物數(shù)量Tab.1 Number of microorganisms in tobacco soil in different periods

2.2 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 門水平細菌

分析各時期煙田土壤中門水平細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)（圖1），相對豐度最高的均是變形菌門（Proteobacteria，29.19%～34.30%），其次是綠彎菌門（Chloroflexi，14.27%～18.50%）、放線菌門（Actinobacteria，9.12%～18.68%）和酸桿菌門（Acidobacteria，12.02%～20.37%）。門水平細菌在健康與發(fā)病土壤中種類相似，但不同煙株生長時期豐度發(fā)生了改變，變化最明顯的是放線菌門（Actinobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）。旺長期放線菌門（Actinobacteria）相對豐度在健康和發(fā)病土壤中較移栽前分別增多了8.86%和7.14%，酸桿菌門（Acidobacteria）分別減少了7.86%和2.99%。發(fā)病土壤中放線菌門（Actinobacteria）豐度高于健康土壤；健康土壤中酸桿菌門（Acidobacteria）豐度在旺長期減少。除此之外，豐度較少的厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）在旺長期增多，擬桿菌門（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）減少。其中健康土壤中厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度較發(fā)病土壤高0.97%，發(fā)病土壤中浮霉菌門（Planctomycetes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）較健康土壤分別高出0.32%、0.48%和0.62%。相對豐度小于1%的細菌同樣在旺長期發(fā)生了變化，如旺長期裝甲菌門（Armatimonadetes）、綠菌門（Chlorobi）相對豐度均降為移栽前的一半。

圖1 土壤細菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.1 Community structure of soil bacteria on the phylum level

2.2.2 屬水平細菌

土壤中屬水平細菌與門水平細菌群落結(jié)構(gòu)變化一致，旺長期和發(fā)病期的細菌群落結(jié)構(gòu)更為相似（圖2）。豐度最高的是norank_c__Acidobacteria，平均相對豐度為3.68%，在移栽前的健康土壤中相對豐度最高（5.90%）。平均相對豐度大于2%的還有norank_f__Acidobacteriaceae__Subgroup_1_（3.04%～4.12%）、norank_f__Anaerolineaceae（1.94%～3.38%）、norank_c__SBR2076（2.07%～2.91%）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira，1.50%～3.29%）、unclassified_f__Micrococcaceae（1.22%～4.02%）。其中變化最明顯的unclassified_f__Micrococcaceae在健康土壤中豐度均高于發(fā)病土壤，旺長期健康土壤中該菌相對豐度是發(fā)病土壤的1.93倍，是移栽前健康土壤的2.46倍。相對豐度小于1%的屬水平細菌數(shù)量龐大，比例之和接近45%。這些細菌在健康和發(fā)病土壤之間同樣存在差異，如Pseudolabrys、Burkholderia-Paraburkholderia在健康土壤中豐度均比發(fā)病土壤高，而地桿菌屬（Terrabacter）、Gaiella、玫瑰彎菌屬（Roseiflexus）在發(fā)病土壤中豐度較高。

2.2.3 細菌物種差異分析

為找出細菌在健康與發(fā)病土壤之間的差異性物種，將細菌相對豐度數(shù)據(jù)運用Wilcox秩和檢驗進行假設(shè)檢驗，評估物種豐度差異的顯著性水平，從而獲得顯著性差異物種。按物種豐度降序，列出了旺長期、發(fā)病期在健康與發(fā)病土壤之間存在顯著差異的前五種細菌（圖3），分別是unclassified_f__Micrococcaceae、norank_o__JG30-KF-AS9、norank_f__Xanthobacteraceae、norank_f__YNPFFP1和norank_c__TK10。其中前三種細菌在健康土壤中豐度較高，后兩種菌在發(fā)病土壤中豐度較高，這些存在顯著差異的物種可能與土壤健康水平有關(guān)。

圖2 土壤細菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Community structure of soil bacteria on the genus level

圖3 細菌在屬水平上的物種差異分析Fig.3 Species difference analysis of soil bacteria on the genus level

2.3 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化

2.3.1 門水平真菌

門水平上真菌種類較少，但在不同煙株生長時期豐度變化較大（圖4）。相對豐度最高的是子囊菌門（Ascomycota，57.27%～91.10%），其次是擔(dān)子菌門（Basidiomycota，2.72%～14.72%）和norank_k__Fungi（2.33%～18.45%），這三種真菌在土壤中相對豐度之和高達93%左右。發(fā)病土壤中子囊菌門（Ascomycota）豐度高于健康土壤，而擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和norank_k__Fungi與之相反。煙株移栽前發(fā)病土壤中子囊菌門（Ascomycota）相對豐度比健康土壤高出16.81%，而健康土壤中擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和norank_k__Fungi相對豐度分別比發(fā)病土壤多7.58%和9.80%；旺長期子囊菌門（Ascomycota）豐度在三個時期中最高，發(fā)病土壤中的相對豐度比健康土壤高3.55%；發(fā)病期子囊菌門（Ascomycota）豐度降低，但在發(fā)病土壤中仍然高于健康土壤，而健康土壤中norank_k__Fungi相對豐度是發(fā)病土壤的2.87倍。

圖4 土壤真菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Community structure of soil fungi on the phylum level

圖5 土壤真菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Community structure of soil fungi on the genus level

2.3.2 屬水平真菌

如圖5所示，屬水平真菌相對豐度最高的是norank_o__Sordariales（17.12%～33.66%），其次為假霉樣真菌屬（Pseudallescheria，2.27%～27.57%）、unclassified_o__Pleosporales（7.53%～11.40%）、unclassified_o__Sordariales（5.59%～10.62%）和norank_k__Fungi（2.33%～18.45%）。其中假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、unclassified_c__Dothideomycetes、unclassified_o__Hypocreales、unclassified_f__Trichocomaceae、unclassified_o__Pezizales均屬于子囊菌門，這些菌在旺長期豐度增多，且均在發(fā)病土壤中較高。

2.3.3 真菌物種差異分析

對旺長期、發(fā)病期土壤樣本進行屬水平上組間物種差異分析（圖6），前五種具有顯著差異的真菌分別是假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、鐮刀菌屬（Fusarium）、norank_o__Tremellales、norank_c__Sordariomycetes和norank_p__Basidiomycota。其中假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）在健康與發(fā)病土壤之間的差異最明顯，該菌在發(fā)病土壤中平均相對豐度是健康土壤的2倍，可能是影響煙草青枯病發(fā)病的重要物種。norank_c__Sordariomycetes的豐度雖然不高，但其顯著性差異最大（0.001

圖6 真菌在屬水平上的物種差異分析Fig.6 Species difference analysis of soil fungi on the genus level

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

2.4.1 Alpha多樣性分析

分析土壤微生物Alpha多樣性可知（表2），本試驗微生物樣本覆蓋度指數(shù)（Coverage）均在0.96以上，表明本次測序可以較好反映樣本中微生物的真實情況。Sobs（the observed richness）值表示物種豐富度實際觀測值，煙株旺長期時細菌Sobs值最高，真菌最低，與前述的微生物數(shù)量分析一致。對各個樣品中微生物豐富度（Sobs、Chao1 ）和多樣性（Shannon）指數(shù)進行比較發(fā)現(xiàn)，健康土壤中細菌和真菌的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均大于發(fā)病土壤，但并未達到顯著性差異。

表2 土壤微生物的多樣性指數(shù)Tab.2 Diversity index of soil microorganism

2.4.2 Beta多樣性分析

圖7 土壤微生物的層級聚類分析Fig.7 Hierarchical clustering analysis of soil microbial samples

Beta多樣性分析是研究不同樣本之間微生物群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系，可對樣本距離矩陣進行聚類分析，構(gòu)建樣本層級聚類樹。通過對旺長期和發(fā)病期土壤樣本進行聚類發(fā)現(xiàn)（圖7），樣本沒有依照煙株生長期聚類，而是以土壤的健康水平進行聚類。細菌在健康和發(fā)病土壤樣本之間的聚類更為明顯，這說明健康和發(fā)病土壤之間因細菌群落結(jié)構(gòu)不同而出現(xiàn)差異。從圖7a中還可以發(fā)現(xiàn)，如B_4_D、C_4_D樣本分別代表旺長期和發(fā)病期洋坑試驗區(qū)的發(fā)病土壤，在樹狀圖中距離最近，這說明地域?qū)毦娜郝浣Y(jié)構(gòu)改變也存在影響。對真菌的層級聚類分析發(fā)現(xiàn)樣本也存在一定的聚類，健康土壤樣本集中在樹狀圖中部，發(fā)病土壤樣本集中在下部，但聚類效果并無明顯規(guī)律。這說明煙田土壤的健康情況與真菌群落結(jié)構(gòu)存在聯(lián)系，但不如細菌緊密。

3 討論

青枯病是福建煙草的主要病害，一般在每年4月下旬或5月上旬由南向北發(fā)生，5月中、下旬遇上適宜的氣候（高溫多雨）開始大規(guī)模爆發(fā)[10]，此時煙株正處于旺長期中后期。根據(jù)微生物數(shù)量和物種組成分析可知，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在旺長期時已經(jīng)發(fā)生了改變，與青枯病出現(xiàn)的時間吻合，這主要由于煙株在旺長期后期根系活力逐漸轉(zhuǎn)弱，根系分泌物減少，因而導(dǎo)致土壤微生物種類和數(shù)量等發(fā)生了變化。旺長期土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)改變可能正是導(dǎo)致煙草青枯病發(fā)病的重要原因。

層級聚類分析顯示出健康與發(fā)病土壤樣本之間存在差異（特別是細菌），這些差異可能由組間差異分析篩選出的物種導(dǎo)致。如細菌中unclassified_f__Micrococcaceae屬于放線菌門（Actinobacteria）中的微球菌科，放線菌以其拮抗特性廣為人知，可產(chǎn)生抗真菌化合物[11]。研究發(fā)現(xiàn)感染青枯病的土壤中微球菌豐度明顯少于健康土壤[12]。Berendsen RL等認為土壤抑病能力不能歸因于一種單獨的微生物或類群，而是受到多種微生物所組成的整體影響[6]。微生物彼此之間通過相互作用，共同承擔(dān)起抑制病害的作用。物種差異分析篩選出的細菌在土壤中的含量雖然較低，但它們在健康與發(fā)病土壤之間存在顯著差異，可以推測健康煙田土壤在受到青枯菌侵染時，受到了以微球菌為主的多種細菌群體的抑制，從而降低了青枯病發(fā)病率。真菌中子囊菌（Ascomycota）豐度在發(fā)病土壤中普遍較多，子囊菌門（Ascomycota）含有數(shù)量龐大的植物病原菌，能夠?qū)χ参锏母吭斐蓳p傷侵害[13]。假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）是健康與發(fā)病土壤之間存在顯著差異且豐度最高的物種，屬于子囊菌門（Ascomycota）中的小囊菌目（Microascales）。小囊菌目（Microascales）中的真菌不僅能引起多種植物病害，而且能引起包括人體在內(nèi)的多種動物病害[14]。鐮刀菌（Fusarium）是含量上僅次于假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）的差異性物種，是一種著名的植物病原菌，可造成多種植物萎焉、根腐[15]。這些真菌雖然不是煙草青枯病的病原菌，但是它們寄生、腐生的營養(yǎng)方式可能會對煙株的根部進行破壞，為青枯病病原菌侵染煙株制造天然的入口[16]。

細菌和真菌的Alpha多樣性分析表明健康土壤中微生物多樣性高于發(fā)病土壤。以往的研究表明，土壤健康水平與微生物多樣性呈正比，高水平的微生物多樣性能夠抑制土傳病害的發(fā)生[17-19]。Beta多樣性分析佐證了微生物群落結(jié)構(gòu)在健康和發(fā)病土壤之間確實存在差異，且細菌比真菌更為明顯。同時Beta多樣性分析也證明了微生物群落結(jié)構(gòu)與地理位置相關(guān)，因而研究土壤微生物與煙草青枯病的關(guān)系時還需要考慮其他生態(tài)因素。

值得注意的是，由于土壤取樣過程中尤其是移栽前和旺長期取樣時煙株尚未發(fā)病，因此很難做到100%的發(fā)病取樣點落在病株10cm范圍內(nèi)，即取樣點可能落到了健康煙株附近，這樣就帶來了取樣土壤的誤差，進而影響土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)和多樣性隨時間變化的誤差。由于煙草青枯病常連片發(fā)生并且每年都在大致相同的區(qū)域內(nèi)發(fā)生，所以本文研究中每次采集土壤時應(yīng)盡量選擇在相同的區(qū)域內(nèi)，并且取樣煙株不少于5株，取土后將5點土壤充分混合均勻后供測試所用，從而盡可能降低因取樣給土壤微生物菌落結(jié)構(gòu)和群體多樣性隨時間變化帶來的誤差。

4 結(jié)論

煙田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在煙株旺長期時已經(jīng)發(fā)生了較大變化，發(fā)病期與旺長期微生物群落結(jié)構(gòu)不同于移栽前。健康煙田土壤中微生物多樣性較高，unclassified_f__Micrococcaceae、norank_o__JG30-KFAS9、假霉樣真菌屬（Pseudallescheria）、鐮刀菌屬（Fusarium）在健康與發(fā)病土壤之間存在顯著差異。微生物群落結(jié)構(gòu)在健康與發(fā)病土壤之間的差異可能是影響煙草青枯病發(fā)生的關(guān)鍵因子之一。因而采取措施提高土壤微生物多樣性和物種豐富度對煙草青枯病的防控、提高土壤健康質(zhì)量會有很大幫助。