煙草品種對鐮刀菌根腐病的抗性鑒定

邱睿，李芳芳，徐敏，李成軍，李小杰，陳玉國，白靜科，孫玥涵，李淑君*

1 河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，河南省許昌市永昌大道與青梅路交叉口 461000；

2 中國煙草總公司河南省公司，河南省鄭州市鄭東新區(qū)商務外環(huán)路15號 450018

1998年，桑維鈞[1]等首次報道我國煙草鐮刀菌根腐病的發(fā)生，近年來，鐮刀菌根腐病在我國煙區(qū)的發(fā)病范圍和發(fā)病程度呈上升趨勢，在云南、河南、湖南、山東、貴州、福建、湖北、安徽等地均有發(fā)生，重病煙田發(fā)病率達30%以上[1-8]。邱睿[9]等研究提示尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病鐮刀菌（Fusarium solani）是河南煙區(qū)鐮刀菌根腐病的優(yōu)勢病原菌。生產(chǎn)上以化學藥劑蘸根移栽和穴施藥劑進行防治，但長期施用化學藥劑會造成病原菌的耐藥性和農(nóng)藥殘留，給生態(tài)環(huán)境和人體健康帶來負面影響[10]。

培育和選用抗病品種是煙草鐮刀菌根腐病最經(jīng)濟有效的防治措施。除陳高航、于慶濤[7,11]等提到我國生產(chǎn)上推廣種植的中煙系列、白肋21、白肋37、烤煙NC89、K326對煙草根腐病具有較強抗性外，關于煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定及抗病品種選育系統(tǒng)研究鮮有報道。目前還沒有煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定標準，僅見其他研究中進行鐮刀菌根腐病致病性測定時的接種方法，如趙杰[12]等利用鐮刀菌粗毒素侵泡煙草幼苗，田艷艷[3]等利用菌餅接種法，陳高航[7]采用孢子懸浮液侵根法，吳安忠[13]等采用盆栽煙株帶菌固體培養(yǎng)料接種法。本文采用采用盆栽煙株接種帶菌麥粒的方法，分析比較了12個煙草品種（系）對煙草鐮刀菌根腐病的苗期抗病性，以期篩選出鐮刀菌根腐病檢測預警材料及鐮刀菌根腐病抗性材料，為鐮刀菌根腐病相關研究及河南煙區(qū)鐮刀菌抗性煙草品種的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中供試菌株尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和茄病鐮刀菌（Fusarium solani） 由課題組采集、分離純化及分子鑒定后保存于河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所菌源庫。供試煙草品種包括中煙98、中煙100、中煙205、貴煙6號、KRK26、豫煙10號、豫煙13號、云煙87、品系7478、NC89、小黃金1025和長脖黃，均由河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草所種質資源庫提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

從活躍生長的5日齡病原菌菌落邊緣取單個4 mm見方菌落塊作為接種體，轉接至1/2馬鈴薯葡糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），置24±1°C黑暗條件下培養(yǎng)，每10 d進行一次繼代培養(yǎng)。

1.2.2 接種方法

將經(jīng)致病性鑒定的分離物在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)，從菌落邊緣打取新鮮的菌絲塊，接種于麥粒培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7 d，制成帶菌麥粒培養(yǎng)物。接種煙株前，將滅菌花盆裝120 g滅菌土，再將帶菌麥粒培養(yǎng)物（每缽接15粒）拌入5 cm左右的表層土中，施足水后在28℃下保濕培養(yǎng)4 d，再移入健壯的煙苗。將接種的煙苗置于28-30℃人工氣候室中保濕培養(yǎng)，以拌入無菌麥粒培養(yǎng)基的煙苗為對照，每個處理重復3次，每個重復處理10株煙苗，每處理共30株煙苗，于接種后第3 d、5 d、7 d、10 d調查各處理發(fā)病情況。

1.2.3 煙株發(fā)病情況調查

接種10 d后，按照煙草病蟲害分級及調查方法GB/T23222-2008規(guī)定[14]逐一調查每盆苗的發(fā)病情況，計算發(fā)病率（I）和病情指數(shù)（D）。

1.2.4 煙草品種的室內抗性測定

依據(jù)“煙草品種抗病性鑒定標準（GB/T 23224-2008）進行抗性評價。高抗或免役（I）：病情指數(shù)為0，抗?。≧）：病情指數(shù)0.1-20，中抗（MR）：病情指數(shù)20.1-40，中感（MS）：病情指數(shù)40.1-60，感?。⊿）：病情指數(shù)60.1-80，高感（HS）：病情指數(shù)80.1-100[15]。

2 結果與分析

2.1 菌株致病性測定

小黃金1025煙苗接種病原菌，逐日進行觀察，于接種后第4～7天開始，接種煙苗出現(xiàn)典型鐮刀菌根腐病癥狀：煙苗葉片由下往上逐漸變黃、皺縮枯萎，煙苗根莖部逐漸腐爛，須根明顯減少，對發(fā)病煙苗進行病原物分離、純化，鏡檢觀察，獲得的純培養(yǎng)物其形態(tài)與接種的病菌相同，證明該接種菌株具有致病性（圖1、2）。

圖1 接種后煙苗發(fā)病癥狀Fig.1 The symptom of tobacco seedlings after inoculation

圖2 病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of the tested Fusarium spp.

2.2 供試煙草品種鐮刀菌根腐病抗性鑒定

通過室內接種調查發(fā)現(xiàn)，12種供試煙草品種對鐮刀菌根腐病的抗性有明顯差異，接種后第10 d，除接種茄病鐮刀菌的豫煙13未表現(xiàn)癥狀外，其余品種均發(fā)病，其中長脖黃感病較早且發(fā)病重，接種3 d后即發(fā)病，接種10 d后，接種致病菌的長脖黃病情指數(shù)達到了89以上。

表2 供試品種接種后發(fā)病情況及對鐮刀菌根腐病的抗性差異Tab.2 Incidence rate of varieties tested after inoculation with F.oxysporum and F.solani

圖3 鐮刀菌根腐病不同抗性煙草品種Fig.3 Tobacco varieties with different resistance to Fusarium root rot

煙草品種的抗性測定結果表明（表2），中煙98、品系7478、NC89、貴煙6號、云煙87和豫煙13號抗鐮刀菌根腐病，其中豫煙13號對茄病鐮刀菌免役；KRK26、中煙100和中煙205中抗鐮刀菌根腐?。恍↑S金1025中感茄病鐮刀菌、感尖孢鐮刀菌；豫煙10號對鐮刀菌根腐病感病，長脖黃高度感病。

3 討論

鐮刀菌根腐病是一種重要的土傳根莖類病害，該病害已逐步上升為煙草的主要病害[11]。選用抗病品種是防病常用有效方法之一[16]，關于煙草鐮刀菌根腐病抗性鑒定還沒有統(tǒng)一的標準方法，目前僅見部分研究在進行煙草鐮刀菌根腐病致病性測定時采用的不同接種方法[3,7,12,13]，這些接種法都具有一個共性，即接種前人為損傷煙草根部，這些方法雖能達到使煙株發(fā)病的目的，但對品種發(fā)病程度起不到鑒定作用。李雪君等[17]采用漂浮苗接種法測定了4種煙草品種對尖孢鐮刀菌根腐病的抗感性，本研究通過盆栽接種麥粒帶菌培養(yǎng)物的方法分析了12種煙草品種對河南省主要的兩種煙草鐮刀菌根腐致病菌病感抗性，與漂浮苗接種法相比，盆栽接種麥粒帶菌培養(yǎng)物方法中的麥粒、培養(yǎng)基等都是經(jīng)過滅菌的，且鑒定操作步驟少，降低了其他致病菌的感染概率；盆栽接種中煙苗栽種于土壤而非基質中，煙苗和鐮刀菌的生活環(huán)境接近大田環(huán)境，該方法鑒定出來的煙草鐮刀菌抗感性更貼近自然發(fā)病情況。本研究發(fā)現(xiàn)測試的中煙98、中煙100、中煙205、NC89對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌具有抗性，這與陳高航[7]提到我國生產(chǎn)上推廣種植的中煙、白肋21、白肋37、烤煙NC89、K326等品種對煙草根腐病的抗性較強結果相符，本研究還發(fā)現(xiàn)貴煙6號、云煙87、7478、豫煙13、KRK26對尖孢和茄病兩種鐮刀菌也具有較高抗性。小黃金1025和長脖黃分別作為煙草根黑腐病和黑脛病的感病品種、豫煙10號作為黑脛病的抗性品種應用于不同研究中[18,19]，本研究首次發(fā)現(xiàn)長脖黃、小黃金1025和豫煙10號對尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌根腐病感病，可作為這兩種鐮刀菌根腐病的感病對照樣品應用于相關研究中。不同地區(qū)生態(tài)條件不同，煙草鐮刀菌根腐病主要致病菌也存在差異，福建煙區(qū)鐮刀菌根腐病的病原菌為共享鐮刀菌[12]（Fusarium commune），貴州和山東煙區(qū)鐮刀菌根腐病的優(yōu)勢病原菌為茄病鐮刀菌[1,5]，湖北煙區(qū)煙草根腐病致病菌為尖孢鐮刀菌[7]等，因此同一品種在不同種植區(qū)域，其抗感性表現(xiàn)也不同，本研究針河南煙區(qū)鐮刀菌根腐病主要致病菌尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌，測定分析了對不同煙草品種對這兩種病原菌的抗感性，而其他不同煙區(qū)應針對本煙區(qū)鐮刀菌根腐病主要致病菌開展相關研究，篩選本適宜煙區(qū)的主栽抗性品種。

4 結論

明確不同煙草品種對煙草鐮刀菌根腐病的抗性存在差異，對煙區(qū)鐮刀菌抗性煙草品種的選用及病害的有效控制具有重要意義。本研究通過測定不同煙草品種對河南煙區(qū)煙草根腐病主要致病菌（尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌）的抗性，確定中煙98、貴煙6號、云煙87、煙草品系7478、NC89和豫煙13號對鐮刀菌具有較高抗性，在鐮刀菌高發(fā)地區(qū)可以根據(jù)需要選擇種植這些煙草品種，KRK26、中煙100和中煙205中等抗病，種植這些煙草品種的煙區(qū)，通過苗床期使用生防菌劑/肥等促進煙苗根系發(fā)育，大田期注意培土、排水等，減少根腐病發(fā)生概率；小黃金1025、豫煙10號和長脖黃對鐮刀菌敏感，可作為對鐮刀菌根腐病檢測預警材料及鐮刀菌根腐病的感病對照樣品應用于相關研究中。