CDR1as在喉鱗狀細胞癌中的作用機制研究

張建中，趙耀新，胡華勇，王燕玲，黃海瓊，蔡剛

(廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院耳鼻喉科，廣東 廣州 510700)

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是僅次于肺癌的常見呼吸道惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增長，2016年約13 430例新發(fā)喉癌被確診、3 620例患者死亡[1]。近年來浸潤性LSCC患者5年生存率反而從66%減少至63%，可能與缺乏明確的診斷、術后局部及區(qū)域性復發(fā)、保喉治療(包括放化療)增多及相關的放化療抵抗有關[2-3]，進一步明確LSCC發(fā)病潛在的分子機制、尋找更有效的治療方法成為臨床研究的熱點。

真核細胞中轉錄生成的RNA中，95%為非編碼RNA，包括短鏈微RNA、長鏈非編碼RNA和環(huán)狀RNA[4]。環(huán)狀RNA是最近在哺乳動物中發(fā)現的內源性非編碼、高度保守、以共價環(huán)存在的RNA分子，具有基因調節(jié)作用。小腦變性相關蛋白1反義轉錄物(cerebellar degeneration-related protein 1 antisense，CDR1as)是最近發(fā)現的一種環(huán)狀RNA，其在胰腺細胞內過表達可顯著促進胰島素合成與分泌[5]，動物腦組織中CDR1as表達不足或缺乏可導致感知能力損害[6]，CDR1as也被證實在胃癌、結直腸癌和肝癌細胞中過表達[7-9]。我們前期研究發(fā)現CDR1as在LSCC細胞中高表達，認為其高表達是判斷預后不良的指標之一。本研究探討上調和敲除CDR1as對LSCC細胞的影響，分析其與微RNA-7(microRNA-7，miR-7)表達的關系及其在LSCC發(fā)病中的作用機制，為尋找新的治療途徑和靶點提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料

TRIzol試劑、脂質體2000、RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、CCK-8試劑盒、反轉錄試劑盒(廣州維伯鑫)。人喉鱗狀細胞癌細胞株Hep-2和AMC-HN-8均購自中國科技大學細胞庫，細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.2 細胞轉染及分組

由廣州萊博生物科技有限公司合成miR-7 mimics及CDR1as-shRNA。Hep-2和AMC-HN-8細胞接種于12孔培養(yǎng)板，分別轉染空白及攜帶CDR1as、CDR1as-shRNA、miR-7 mimic脂質體2000，均嚴格按說明書操作。將細胞分為空白對照組(Ⅰ組)、CDR1as組(Ⅱ組)、空轉染對照組(Ⅲ組)、轉染CDR1as-shRNA組(Ⅳ組)，檢測CDR1as對Hep-2和AMC-HN-8細胞的作用。檢測CDR1as調節(jié)miR-7靶基因及蛋白作用的實驗中，細胞分為4組，分別為空白對照組(Ⅰ組)、轉染miR-7 mimics組(Ⅱ組)、轉染CDR1as組(Ⅲ組)、轉染CDR1as+miR-7 mimics組(Ⅳ組)。

1.3 細胞活性檢測

轉染的細胞系培養(yǎng)成熟后，使用PBS沖洗，按CCK-8試劑盒說明書操作，酶標記法測量450 nm波長吸光度值分析細胞活性。

1.4 克隆形成檢測

收獲過表達CDR1as或(和)miR-7的細胞系，重懸于含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，然后接種于12孔板中培養(yǎng)10 d，0.1%結晶紫染色，甲醇處理15 min，熒光顯微鏡下觀察，記錄大于50個細胞的克隆細胞集落。

1.5 細胞凋亡檢測

細胞使用碘化丙啶染色，37 ℃避光保存30 min后檢測細胞周期。-20 ℃條件下70%乙醇處理細胞2 h后進行細胞凋亡檢測。加入10 mg/mL核糖核酸酶，按照說明書操作，用2 μL annexin V和2 μL碘化丙啶染色，流式細胞術進行檢測。

1.6 遷徙和侵襲能力檢測

采用Transwell實驗檢測細胞遷徙和侵襲能力。將轉染CDR1as或(和)miR-7的細胞加到無被覆Transwell小室的上室中檢測細胞侵襲。發(fā)生遷徙和侵襲的腫瘤細胞被基底膜基質覆蓋，未發(fā)生遷移和侵襲的細胞用棉簽移除，結晶紫染色，顯微鏡下隨機選擇5個視野進行細胞計數。

1.7 免疫印跡

使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離提取的細胞總蛋白，將蛋白帶轉移到硝化纖維膜上，室溫下TBST液中以5%脫脂牛奶封閉1 h。以GAPDH作為內參照，加入特異性一抗室溫孵育過夜，TBST液充分洗膜，加入HRP交聯二抗室溫孵育1 h，TBST液沖洗，加入ECL發(fā)光液顯影。

1.8 實時定量PCR

按TRIzol試劑盒說明書提取細胞總RNA，使用反轉錄試劑盒反轉錄生成cRNA。以GAPDH為內參照，實時定量PCR檢測CDR1as、miR-7、細胞周期蛋白E1(CCNE1)、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ(PIK3CD) mRNA表達。引物序列：CDR1as上游引物5′-TAGTACGTCGTGCCCTGA-3′，下游引物5′-CACTTGACGTGCAGCATC-3′； miR-7上游引物5′-CCACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3′，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′； CCNE1上游引物5′-ATGAAGAAGTTGAACCATGCCA-3′，下游引物5′-CCTCCAGAACAGTATTCCATTGC-3′； PIK3CD上游引物5′-AAGGAGGAGAATCAGAGCGTT-3′，下游引物5′-GAAGAGCGGCTCATACTGGG-3′；GAPDH上游引物5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′，下游引物5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3′。PCR擴增步驟：95 ℃ 10 s，94 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。實驗重復3次，用2-△△Ct法計算目的基因的表達量。

1.9 熒光免疫組織化學

參照文獻[10]采用熒光免疫組織化學檢測各組細胞CCNE1和PIK3CD蛋白表達，以Ki-67表達為陽性對照。

1.10 統計分析

采用SPSS 16.0軟件分析處理數據。兩組數據組間比較用t檢驗或U檢驗，多組數據組間比較用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDR1as mRNA表達檢測

實時定量PCR顯示，與空白對照組比較，轉染CDR1as后Hep-2和AMC-HN-8細胞CDR1as mRNA表達均顯著增加，而轉染CDR1as-shRNA后CDR1as mRNA表達均顯著降低(均P<0.01)。見圖1。顯示Hep-2和AMC-HN-8細胞過表達和敲除CDR1as基因模型構建成功。

注：組間比較，**P<0.01，***P<0.001

圖1 轉染CDR1as、CDR1as-shRNA后兩種細胞系CDR1as mRNA表達檢測(實時定量PCR)

2.2 細胞活性檢測

與對照組相比，轉染CDR1as后兩種細胞系細胞活性均明顯增加；與空染組相比，轉染CDR1as-shRNA后兩種細胞系細胞活性均明顯降低(均P<0.05)；而空染組與對照組相比細胞活性差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。顯示過表達CDR1as可增加腫瘤細胞活性，敲除CDR1as后細胞活性明顯降低。

注：組間比較，*P<0.05,**P<0.01

圖2 轉染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后兩種細胞系細胞活性檢測(CCK-8法)

2.3 細胞分化和細胞集落形成檢測

轉染CDR1as后兩種細胞系細胞分化及細胞集落形成均明顯增加，而轉染CDR1as-shRNA后細胞分化及細胞集落形成均明顯受到抑制(均P<0.01)。見圖3，圖4。顯示過表達CDR1as導致細胞分化增加、細胞集落形成增多，而敲除CDR1as后上述作用被抑制。

2.4 細胞周期和細胞凋亡檢測

轉染CDR1as后兩種細胞系細胞停留于S期，細胞合成、分裂能力增強；而轉染CDR1as-shRNA后細胞停留在G0/G1期，誘導凋亡(均P<0.01)。見圖5。顯示過表達CDR1as能促進細胞增殖，敲除CDR1as后導致細胞停留在G0/G1期并誘導細胞凋亡。

注：組間比較，**P<0.01

圖3 轉染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后兩種細胞系細胞分化檢測(流式細胞術)

注：組間比較，**P<0.01

圖4 轉染CDR1as、NC-shRNA、CDR1as-shRNA后兩種細胞系細胞集落形成檢測

2.5 細胞遷徙和侵襲能力檢測

Transwell實驗顯示，與對照組比較，轉染CDR1as后兩種細胞系的細胞遷徙和侵襲能力增強，而轉染CDR1as-shRNA后細胞遷徙和侵襲能力減弱(均P<0.01)。見圖6。即CDR1as過表達能增加細胞遷徙和侵襲能力。

2.6 CDR1as調節(jié)miR-7的靶基因及蛋白表達檢測

空白對照組CCNE1和PIK3CD基因及蛋白均有表達，轉染miR-7 mimics后兩者表達顯著降低，而轉染CDR1as后兩者表達顯著增加，證實miR-7的靶基因CCNE1和PIK3CD均能被CDR1as調節(jié)；而同時轉染CDR1as+miR-7 mimics組與轉染CDR1as組之間上述兩種蛋白表達有顯著差異，表明miR-7表達恢復可抵消CDR1as調節(jié)LSCC的過程并抑制CCNE1和PIK3CD表達。見圖7。說明CDR1as誘導LSCC是通過調節(jié)miR-7/CCNE1/PIK3CD軸而發(fā)揮作用。

3 討論

盡管通過手術、放療及生物免疫治療等綜合手段，LSCC患者特別是晚期患者總體生存率在過去十幾年并沒有得到顯著提高[1]，表明LSCC發(fā)生的分子機制還有待進一步認識。癌癥基因組圖譜研究顯示在LSCC中存在EGFR、ERBB2、CCND1、TP53、PIK3CD等多個潛在的治療靶點，在腫瘤形成過程中CDR1as上調可以通過EGFR/RAF1/MAPK或PTEN/PI3K/AKT信號通路而減弱具有腫瘤抑制作用的miR-7的功能而發(fā)揮致癌基因作用[10]。

與線性RNA不同，環(huán)狀RNA的3，和5，端通過共價鍵連接形成環(huán)形結構，這可阻止其被RNA核酸外切酶降解，保證其結構穩(wěn)定性并使其大量表達于真核細胞質中。環(huán)狀RNA具有保守性、豐富性及組織特異性，發(fā)揮腫瘤調節(jié)作用，并作為腫瘤特異性的分子標記物[11]。研究證實環(huán)狀RNA可競爭內生性微RNA(miRNA)或作為miRNA海綿體在多種生物過程及疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮基因調節(jié)作用。研究顯示，環(huán)狀RNA在LSCC中存在表達失衡現象，其中hsa_circRNA_100855上調最明顯、hsa_circRNA_104912下調最顯著，表明環(huán)狀RNA在LSCC發(fā)生、發(fā)展及預后方面起著重要作用[12]。本研究中培養(yǎng)兩種細胞系Hep-2和AMC-HN-8，通過過表達與敲除兩個相反的方向給予實驗干預，觀察細胞活性、生長速度、凋亡、遷徙及侵襲能力，發(fā)現CDR1as過表達導致細胞生長旺盛、細胞凋亡減少、遷徙和侵襲能力增強，而敲除CDR1as后細胞上述表現則相反，從而認為CDR1as在LSCC中為促癌基因。

注：A：細胞周期檢測；B：細胞凋亡檢測；組間比較，**P<0.01

注：組間比較，**P<0.01

注：A：4組Hep-2細胞CCNE1和PIK3CD mRNA表達(PCR)；B：4組Hep-2細胞CCNE1和PIK3CD蛋白表達(熒光免疫組織化學)；C：4組AMC-HN-8細胞CCNE1和PIK3CD mRNA表達(PCR)；D：4組AMC-HN-8細胞CCNE1和PIK3CD蛋白表達(熒光免疫組織化學)；組間比較，**P<0.01

圖7 CDR1as調節(jié)兩種細胞系的miR-7靶基因及蛋白表達檢測

環(huán)狀RNA因為其環(huán)形結構包含miRNA結合位點，即miRNA反應元件，這些元件發(fā)揮著海綿體作用。在高表達CDR1as的肝癌細胞中敲除CDR1as基因后， miR-7表達上調、CCNE1和PIK3CD基因表達下調，其腫瘤分化及侵襲被抑制[13]。結直腸癌的體內實驗顯示，CDR1as可通過阻止miR-7的腫瘤抑制作用而促進腫瘤生長；敲除CDR1as后結直腸癌細胞的分化及侵襲受到抑制，而轉染miR-7抑制劑可恢復CDR1as被敲除的功能[6]。本研究中，我們發(fā)現轉染miR-7 mimics，可促進腫瘤生長和侵襲的基因CCNE1和PIK3CD低表達，轉染CDR1as后兩者高表達，同時轉染CDR1as+miR-7 mimics導致兩者表達降低，表明CDR1as通過調節(jié)CCNE1和PIK3CD促進腫瘤生長和侵襲，這種作用可被miR-7所抵消。本研究證實在LSCC細胞中，CDR1as通過miR-7信號通路促進腫瘤發(fā)生、增殖、遷延及侵襲。

綜上述，本研究發(fā)現CDR1as可通過miR-7/CCNE1/PIK3CD信號通路促進LSCC的發(fā)生、發(fā)展和轉移，CDR1as可能成為LSCC的一項新的生物標記物和潛在的治療靶點。