伯氏瘧內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白SEY1敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

劉 影 ，史小雨 ，王 倩

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津300070）

瘧疾（Malaria）是由瘧原蟲(chóng)（Plasmodium）引起的，以按蚊為主要傳播媒介的全球性寄生蟲(chóng)病，以非洲地區(qū)的發(fā)病率和死亡率最高。我國(guó)的瘧疾傳染由于滅蚊等努力一度絕跡，但近年來(lái)在南方一些省份已顯死灰復(fù)燃之勢(shì)，且面臨著嚴(yán)重耐藥問(wèn)題[1-3]。目前瘧疾相關(guān)研究過(guò)多的集中在疫苗和藥物研發(fā)，卻忽略了對(duì)瘧原蟲(chóng)生物學(xué)機(jī)理的探索。

瘧原蟲(chóng)作為一種真核生物，其致病性及宿主的免疫應(yīng)答都與瘧原蟲(chóng)的蛋白質(zhì)分泌密切相關(guān)。瘧原蟲(chóng)分泌的蛋白不僅嵌入自身質(zhì)膜，還會(huì)進(jìn)入納蟲(chóng)泡腔以及宿主細(xì)胞的胞漿，甚至還會(huì)嵌入宿主細(xì)胞的質(zhì)膜中[4-5]，在細(xì)胞黏附、免疫隔離、信號(hào)傳遞等多個(gè)過(guò)程發(fā)揮重要作用[6-7]，以創(chuàng)造更利于自身生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境。因此，研究瘧原蟲(chóng)蛋白質(zhì)分泌過(guò)程，特別是與蛋白分泌密切相關(guān)的細(xì)胞器—內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER），對(duì)探究瘧原蟲(chóng)的致病機(jī)制尤為重要。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核生物中最大的膜包被細(xì)胞器，由不間斷的片狀和管狀結(jié)構(gòu)組成。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與多種重要細(xì)胞活動(dòng)，均與其形態(tài)特征密切相關(guān)，特別是蛋白質(zhì)分泌功能[8]。多個(gè)整合膜蛋白家族成員已被發(fā)現(xiàn)參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的維持，如DP1、Atlastin和RTN等。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白（ER-shaping protein）Atlastin，屬于 dynamin超家族的GTP酶，主要通過(guò)介導(dǎo)同源膜融合來(lái)構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管狀網(wǎng)絡(luò)[9-10]，其缺失會(huì)減少COP II囊泡的形成，從而影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成加工蛋白的運(yùn)輸[11]，說(shuō)明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常形態(tài)的維持與蛋白質(zhì)分泌功能密切相關(guān)。此前已有研究嘗試觀察紅外期和紅內(nèi)期瘧原蟲(chóng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)[12]，但瘧原蟲(chóng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的具體功能及其在瘧原蟲(chóng)致病性方面的作用目前尚無(wú)研究。通過(guò)瘧原蟲(chóng)基因組分析，筆者在伯氏瘧原蟲(chóng)（Plasmodium berghei,P.berghei）中找到哺乳動(dòng)物Atlastin蛋白的同源蛋白PbSEY1（P.bergheiSEY1）。SEY1 在其他細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)和功能維持中很重要，然而，筆者目前并不了解它如何在瘧原蟲(chóng)中發(fā)揮功能，以及這些功能與蛋白質(zhì)分泌及瘧原蟲(chóng)致病性之間的關(guān)系。

為了探究伯式瘧原蟲(chóng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白PbSEY1在瘧原蟲(chóng)寄生及致病過(guò)程中的作用，本研究利用敲除-回復(fù)載體pL0034，構(gòu)建pL0034-△PbSey1重組質(zhì)粒，結(jié)合瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染技術(shù)，基于單交換（single crossover）的同源重組（homologous recombination）原理，將PbSey1從瘧原蟲(chóng)基因組中敲除，構(gòu)建PbSey1缺失的瘧原蟲(chóng)突變體，且在后續(xù)回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，該突變體在藥物作用下可直接恢復(fù)PbSey1的表達(dá)，為探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白PbSey1在瘧原蟲(chóng)致病性方面的作用提供了有力的工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 伯氏瘧原蟲(chóng)P.bergheiANKA由羅格斯大學(xué)新澤西醫(yī)學(xué)院Purnima Bhanot教授贈(zèng)予，大腸桿菌載體pL0034于本實(shí)驗(yàn)室保存（圖1），克隆感受態(tài)細(xì)胞Mach1-T1購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TransGen Biotech公司，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRV、NotI、KpnI及T4 DNA連接酶購(gòu)自ThermoFisher公司，乙胺嘧啶購(gòu)自Sigma公司，細(xì)胞核轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Lonza公司。

圖1 pL0034質(zhì)粒圖譜Fig 1 Plasmid profile of pL0034

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因片段Segment I和Segment II的獲取 以野生型伯氏瘧原蟲(chóng)PbSey1基因的編碼區(qū)（1-2742bp）為模板，分別擴(kuò)增兩個(gè)片段Segment I（S I，26-1059bp）和 Segment II（S II,1050-1958bp），并在兩個(gè)片段上下游分別引入KpnI、EcoRV和KpnI、NotI酶切位點(diǎn)（PCR引物見(jiàn)表1）。PCR條件為：94℃預(yù)變性 30 s，以 98 ℃ 10 s，58 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，循環(huán)35次，68°C 5 min，4°C終止反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳確定PCR產(chǎn)物片段大小正確后切膠回收，再將片段S II經(jīng)KpnI、NotI酶切，酶切產(chǎn)物純化后備用。

表1 目的片段PCR擴(kuò)增引物Tab 1 PCR primers

1.2.2 重組質(zhì)粒pL0034-△PbSey1的構(gòu)建 先將片段S II通過(guò)酶切位點(diǎn)KpnI和NotI與pL0034在T4 DNA連接酶的催化下16℃連接過(guò)夜，次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Mach1-T1中，在含有氨芐的固體培養(yǎng)基上37°C倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽(yáng)性單克隆后搖菌擴(kuò)增提取質(zhì)粒。酶切鑒定及DNA測(cè)序確認(rèn)片段S II插入無(wú)誤后，利用In-Fusion無(wú)縫克隆的方法將片段S I與KpnI和EcoRV雙酶切后的質(zhì)粒 pL0034-S II連接（條件為 50°C，30 min），將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行氨芐篩選培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，酶切鑒定及DNA測(cè)序確認(rèn)片段S I插入正確。

1.2.3 瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染 將液氮中凍存的伯氏瘧原蟲(chóng)感染血液通過(guò)尾靜脈注射感染W(wǎng)istar大鼠。每日鼠尾取血制備薄血片，Giemsa染色，油鏡觀察并計(jì)算蟲(chóng)血率。待蟲(chóng)血率升至3%～5%時(shí)，心臟取血收集大鼠血液，加入10 mL完全培養(yǎng)基，離心（200 g，8 min），棄去上清后將全部血細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至150 mL完全培養(yǎng)基中，充入 5%CO2、5%O2、90%N2混合氣體，于 500 mL 密封錐形瓶中，37°C、77～80 r/min條件下培養(yǎng)16～23 h。次日制備血涂片檢查培養(yǎng)狀況，若80%左右瘧原蟲(chóng)發(fā)育為成熟裂殖體即可進(jìn)行分離純化。將培養(yǎng)液體分至4個(gè)50 mL離心管中，每管35mL，在底部緩慢加入10 mL Nycodenz/PBS溶液（密度梯度溶液），使二者產(chǎn)生明顯界面，離心（200 g，25 min）。離心后在培養(yǎng)基與密度梯度離心液之間形成一個(gè)棕色液體薄層，即為裂殖體細(xì)胞層，用吸管小心將該層吸出，完全培養(yǎng)基洗滌1次，棄凈上清后置于冰上備用。將 100 μL Nucleofector溶液、10 μg 重組質(zhì)粒及30 μL分離得到的裂殖體混合電擊后，尾靜脈注入BALB/c小鼠，再經(jīng)乙胺嘧啶篩選獲得成功轉(zhuǎn)染的瘧原蟲(chóng)。

2 結(jié)果

2.1 瘧原蟲(chóng)PbSey1基因敲除及回復(fù)策略 以野生型伯氏瘧原蟲(chóng)Sey1基因編碼區(qū)為模板構(gòu)建的質(zhì)粒pL0034-△PbSey1，轉(zhuǎn)染后首先進(jìn)行第一次同源重組（圖2A），發(fā)生重組的同源臂為Segment II，使Sey1因片段缺失及無(wú)啟動(dòng)子而無(wú)法表達(dá)，即只有發(fā)生Segment II重組的瘧原蟲(chóng)才能產(chǎn)生△Sey1的基因型，同時(shí)表達(dá)抗藥標(biāo)簽hDHFR（human dihydrofolate reductase），可在乙胺嘧啶（pyrimethamine）篩選中存活，最終經(jīng)單克隆篩選即可得到敲除Sey1的瘧原蟲(chóng)。

獲得PbSey1缺失瘧原蟲(chóng)突變體后即可觀察其表型并進(jìn)行相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。為了滿足后續(xù)回復(fù)實(shí)驗(yàn)的需求，本文所使用的基因敲除策略在進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)需重新構(gòu)建回復(fù)質(zhì)粒，只需在藥物篩選作用下發(fā)生第二次單交換的同源重組即可得到PbSey1回補(bǔ)的野生基因型。在5-氟胞嘧啶的作用下，Pb-△Sey1將進(jìn)行第二次同源重組（圖2B），同源臂為Segment I，重組可導(dǎo)致耐藥標(biāo)簽hDHFR-yFCU的丟失而PbSey1重新表達(dá)。未發(fā)生第二次重組的瘧原蟲(chóng)因含有標(biāo)簽yFCU（yeast enzyme cytosine deaminase and uridyl phosphoribosyl transferase），可將5-氟胞嘧啶轉(zhuǎn)化為有毒性的5-氟尿嘧啶而被殺死，由此即可得到PbSey1回補(bǔ)的野生型瘧原蟲(chóng)。

圖2 瘧原蟲(chóng)PbSey1基因敲除及回復(fù)策略Fig 2 PbSey1 knockout and rescue strategy in Plasmodium

2.2 重組質(zhì)粒pL0034-△PbSey1的構(gòu)建和鑒定 由于酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)的不同，首先擴(kuò)增和插入的片段是Segment II（909bp）（圖3A）。在其5′端第10位堿基引入一個(gè)點(diǎn)突變（T＞C）（圖3C），在不影響其氨基酸編碼的前提下產(chǎn)生酶切位點(diǎn)EcoRV（GATATC），同時(shí)在EcoRV（綠色箭頭顯示）的上游引入酶切位點(diǎn)KpnI（藍(lán)色箭頭顯示）；在Segment II的3′端引入酶切位點(diǎn)NotI（紅色箭頭顯示）（圖3C）。利用KpnI和NotI兩個(gè)酶切位點(diǎn)插入S II即可得到質(zhì)粒pL0034-S II，酶切鑒定及DNA測(cè)序證明插入片段正確（圖3A）。

pL0034-S II構(gòu)建成功后，擴(kuò)增、插入片段Segment I（1034 bp）（圖3B）。在S I的5′端引入酶切位點(diǎn)KpnI（藍(lán)色箭頭顯示），與S II相同，在3′端的末位堿基引入點(diǎn)突變（T＞C）而產(chǎn)生酶切位點(diǎn)EcoRV（綠色箭頭顯示）（圖3C）。利用In-Fusion無(wú)縫克隆方法將S I插入質(zhì)粒pL0034-S II，即得到質(zhì)粒pL0034-△PbSey1，KpnI和NotI酶切鑒定及 DNA測(cè)序證明插入片段正確（圖3B）。最后經(jīng)EcoRV酶切將質(zhì)粒線性化后即可用于瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染。

圖3 重組質(zhì)粒pL0034-△PbSey1的構(gòu)建和鑒定Fig 3 Construction and identification of recombinant plasmid pL0034-△PbSey1

2.3 瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染及重組子的鑒定 伯氏瘧原蟲(chóng)經(jīng)同步化培養(yǎng)后約80%的瘧原蟲(chóng)均已發(fā)育為成熟裂殖體，在此階段進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率最高。經(jīng)電轉(zhuǎn)后的瘧原蟲(chóng)在小鼠體內(nèi)生長(zhǎng)，每日監(jiān)測(cè)血涂片，100倍油鏡下觀察100個(gè)視野，若觀察到瘧原蟲(chóng)即為陽(yáng)性，未找到則為陰性。轉(zhuǎn)染后次日即出現(xiàn)瘧原蟲(chóng)陽(yáng)性，于小鼠飲水中加入乙胺嘧啶，給藥2 d后血涂片瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)為陰性，遂撤藥。停藥后第5天瘧原蟲(chóng)再次轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，至停藥后第9天蟲(chóng)血率長(zhǎng)至5%，心臟取血純化瘧原蟲(chóng)，提取基因組DNA，PCR鑒定及PCR產(chǎn)物DNA測(cè)序結(jié)果提示成功獲得PbSey1缺失瘧原蟲(chóng)突變體，但為混合克隆，PCR條帶灰度分析顯示PbSey1缺失瘧原蟲(chóng)突變體約占50%（表2，圖4）。

表2 PCR鑒定PbSey1敲除瘧原蟲(chóng)引物Tab 2 PCR identification primers of PbSey1-deleted parasites

圖4 瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染后重組子的鑒定Fig 4 PCR identification of PbSey1-deleted Plasmodium integrants

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成和鈣儲(chǔ)存的關(guān)鍵細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)和功能對(duì)真核生物的生存和繁殖極為重要，對(duì)于瘧原蟲(chóng)也是如此。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白SEY1通過(guò)介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)同源膜融合參與管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，若SEY1缺失將會(huì)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的形態(tài)和功能以及細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育造成影響。在哺乳動(dòng)物中，Atlastin GTP酶（同源蛋白SEY1）的缺失會(huì)影響COP II包被囊泡的出芽生長(zhǎng)，從而對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白的運(yùn)輸產(chǎn)生負(fù)作用；人體內(nèi)Atlastin（ATL）的缺失會(huì)造成遺傳性痙攣性截癱（hereditary spastic paraplegia，HSP）[13]；在擬南芥植物，其同源蛋白R(shí)HD3（root hair defective 3）的缺失則會(huì)影響生長(zhǎng)素水平及生長(zhǎng)素運(yùn)輸機(jī)制穩(wěn)態(tài)，從而引起植物矮小，根毛變短和卷曲[14]；在果蠅中，ATL缺失會(huì)導(dǎo)致其神經(jīng)元缺陷[15]；在白色念珠菌中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜融合延遲甚至片段化則會(huì)使其毒力和致病力降低[16]。這些研究結(jié)果都為筆者研究PbSEY1在瘧原蟲(chóng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的作用提供了依據(jù)和方向，促使筆者繼續(xù)探究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形蛋白PbSEY1在瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)和致病過(guò)程中的作用。

在瘧原蟲(chóng)中進(jìn)行某種蛋白功能研究時(shí)，除了敲除該種蛋白外，對(duì)敲除株進(jìn)行蛋白回補(bǔ)也是必不可少的實(shí)驗(yàn)步驟。在本研究中，筆者利用基因同源重組原理及質(zhì)粒pL0034上藥物篩選標(biāo)簽hDHFR和yFCU，將基因敲除和基因回復(fù)兩個(gè)截然相反的實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜诤显谝粋€(gè)重組質(zhì)粒中，避免了后期因回復(fù)實(shí)驗(yàn)而重復(fù)構(gòu)建質(zhì)粒及再次進(jìn)行瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染[17]。此外，該質(zhì)粒在進(jìn)行PbSEY1的基因回復(fù)時(shí)是在瘧原蟲(chóng)基因組中PbSEY1的原位進(jìn)行回復(fù)，其表達(dá)量仍與野生型瘧原蟲(chóng)一致，對(duì)基因組的其他序列也不會(huì)產(chǎn)生影響，確保了回復(fù)后瘧原蟲(chóng)基因組的完整性和準(zhǔn)確性。

通過(guò)瘧原蟲(chóng)同步化培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染技術(shù)成功在伯氏瘧原蟲(chóng)中敲除PbSEY1，獲得了PbSEY1缺失瘧原蟲(chóng)與野生型瘧原蟲(chóng)的混合克隆。這是由于在乙胺嘧啶藥物篩選過(guò)程中少量未發(fā)生同源重組的野生型瘧原蟲(chóng)自發(fā)突變，獲得耐藥性而存活下來(lái)。對(duì)于混合克隆，常規(guī)應(yīng)進(jìn)行單克隆篩選，但筆者在進(jìn)行單克隆篩選時(shí)卻遇到了重重困難。筆者常規(guī)采用稀釋法進(jìn)行單克隆篩選，即每只小鼠僅尾靜脈注射1個(gè)瘧原蟲(chóng)，經(jīng)多次嘗試卻始終無(wú)法得到PbSEY1缺失的單克隆蟲(chóng)株。據(jù)此，推測(cè)PbSEY1與其他物種中的同源蛋白有所不同，可能在瘧原蟲(chóng)血液階段的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，以至于PbSEY1敲除蟲(chóng)株無(wú)法單獨(dú)存活，其在瘧原蟲(chóng)致病性方面的具體作用機(jī)制還有待于結(jié)合其它分子工具進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜塑形蛋白SEY1及其同源蛋白在細(xì)胞內(nèi)有著不可或缺的作用，筆者推測(cè)在瘧原蟲(chóng)體內(nèi)更是如此。本研究成功構(gòu)建了PbSEY1敲除-回復(fù)重組質(zhì)粒pL0034-△PbSey1，建立了穩(wěn)定的瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染平臺(tái)，為后續(xù)深入研究SEY1蛋白在瘧原蟲(chóng)中的具體功能提供了有利工具。