網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究神效瓜蔞散治療乳腺癌作用機(jī)制

付精精，吳雄志

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

乳腺癌是世界范圍內(nèi)確診率最高的癌癥，每年新增病例167萬例，死亡人數(shù)超過50萬[1]，據(jù)報(bào)道，乳腺癌是女性癌癥死亡的主要原因[2]，中國(guó)女性新診斷的癌癥中有15%是乳腺癌[3]，其中75%的乳腺癌是雌激素ER陽(yáng)性[4]。中醫(yī)是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，中草藥常用來治療不同類型癌癥，不僅可以減輕癌癥疼痛、嘔吐、腹瀉、疲乏、白細(xì)胞減少等化療副作用，還有抗增殖、抗遷移等作用，可以提高患者生存率[5-7]。神效瓜蔞散是傳統(tǒng)的中藥方劑，來源自宋·陳自明的婦科著作《婦人良方》，由瓜蔞、甘草、當(dāng)歸、乳香、沒藥組成，主治乳癰及一切癰疽初起，其中“乳癰”為古代文獻(xiàn)常見的類似乳腺癌表現(xiàn)疾病，故選取神效瓜蔞散研究其抗乳腺癌的作用機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-通路”多層次網(wǎng)絡(luò)分析藥效活性成分和可能的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,旨在建立中藥及其復(fù)方多成分、多途徑、多靶點(diǎn)間的協(xié)同作用聯(lián)系[8-10]。本文將進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證神效瓜蔞散對(duì)乳腺癌的抑制作用，再運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的思路和方法,預(yù)測(cè)神效瓜蔞散作用于乳腺癌的靶點(diǎn),運(yùn)用Western驗(yàn)證蛋白，探討神效瓜蔞散作用乳腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 神效瓜蔞散的瓜蔞、甘草、當(dāng)歸、乳香和沒藥均購(gòu)買自北京同仁堂大藥房。藥物經(jīng)過浸泡、煮沸、過濾、旋蒸、凍干等步驟得到神效瓜蔞散的水提物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系SKBR-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃，95%的空氣和5%CO2的飽和濕度下培養(yǎng)。SKBR-3購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞增殖試驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)染色法和MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活和增殖情況。臺(tái)盼藍(lán)染色法是對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的乳腺癌SKBR-3細(xì)胞1×104/孔密度鋪在24孔板培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300 和 400 μg/mL），細(xì)胞計(jì)數(shù)使用0.4%的臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)。MTS法將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的乳腺癌SKBR-3細(xì)胞1×104/mL鋪在96孔板培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300和400μg/mL），每孔加入 20μLMTS，用美國(guó) Bio-Rad微孔板光度計(jì)在490 nm處測(cè)定吸光度（OD）值。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的乳腺癌SKBR-3細(xì)胞（10×104）鋪在24孔板培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組、神效瓜蔞散劑量組（50、100、200、300和400μg/mL），劃痕分別在0、6、12、24和48h拍照。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 對(duì)數(shù)增長(zhǎng)的乳腺癌SKBR-3細(xì)胞（20×104）鋪在6孔板培養(yǎng)，設(shè)置空白對(duì)照組、神效瓜蔞散劑量組（100、200 μg/mL），收集培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞,裂解細(xì)胞提取蛋白。采用Western blot法檢測(cè)ERα的表達(dá)水平,以β-actin為空白對(duì)照,操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.3.1 藥物有效成分的收集和靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過先前研究[11]，神效瓜蔞散的5個(gè)藥物成分分別從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)查找有效成分，其中按照類藥性＞0.18篩選有效成分，再通過pubchem、drugbank、chemmapper等數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)藥物結(jié)構(gòu)的相似性找到有效成分相應(yīng)靶點(diǎn)。

1.3.2 乳腺癌的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 乳腺癌的靶點(diǎn)通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù) TTD（Therapeutic Target Database）和 Pubmed、知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)中篩選。

1.3.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 將預(yù)測(cè)到神效瓜蔞散的有效成分的靶點(diǎn)和乳腺癌的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，并通過Cytoscape軟件,根據(jù)成分與靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的程度、匹配的程度制作對(duì)應(yīng)中藥的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)其進(jìn)行歸納和總結(jié)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 圖標(biāo)使用Excel、PowerPoint和GraphPad Prism 5生成圖形。使用社會(huì)科學(xué)SPSS12.0的統(tǒng)計(jì)軟件包確定統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果

2.1 神效瓜蔞散水提物的提取結(jié)果 買自北京同仁堂的神效瓜蔞散240 g經(jīng)過浸泡、煮沸、過濾、旋蒸、凍干等步驟得到110 g神效瓜蔞散水提物。

2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 臺(tái)盼藍(lán)法結(jié)果 使用臺(tái)盼藍(lán)法加入不同劑量神效瓜蔞散（50、100、200 、300 和 400 μg/mL）后，連續(xù)計(jì)數(shù)乳腺癌SKBR-3細(xì)胞6 d，觀察不同劑量組細(xì)胞數(shù)目變化和差異，發(fā)現(xiàn)在劑量為50 μg/mL的低劑量組就出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目的明顯減少，并且呈劑量依賴性，且在第3天細(xì)胞數(shù)目開始明顯減少，呈時(shí)間依賴性（P＜0.05），見圖1。

圖1 SKBR-3細(xì)胞在不同劑量藥物臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)Fig 1 SKBR 3 cells trypan blue countings at different doses

2.2.2 MTS法結(jié)果 MTS實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、不同劑量神效瓜蔞散（50、100、200、300 和 400 μg/mL）組后，72hOD值見圖2，從圖中可以看出，隨著神效瓜蔞散濃度的增加，OD值呈劑量依賴性下降（P＜0.05）。

圖2 SKBR-3細(xì)胞在不同劑量組藥物MTS的OD值Fig 2 OD value of the MTS for SKBR 3 cells at different dose drugs

臺(tái)盼藍(lán)法和MTS實(shí)驗(yàn)說明神效瓜蔞散能夠抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR-3增殖，且呈劑量、時(shí)間依賴性。2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為了初步探索神效瓜蔞散與乳腺癌SKBR-3細(xì)胞遷移的關(guān)系，采用劃痕實(shí)驗(yàn)方法。劃痕實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、不同劑量神效瓜蔞散（100、200 μg/mL）組后，24 h 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 3，從圖中可以看出和空白對(duì)照組相比，各加藥組細(xì)胞遷移的距離明顯減少，說明神效瓜蔞散能夠抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的遷移，且呈劑量依賴性。

圖3 SKBR-3細(xì)胞在不同劑量組藥物的24 h劃痕（4×100）Fig 3 SKBR 3 cell scratches at different doses for 24 h（4×100）

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.4.1 藥物有效成分的收集和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 神效瓜蔞散的瓜蔞、甘草、當(dāng)歸、乳香和沒藥5個(gè)成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)、TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)等數(shù)據(jù)庫(kù)，按照類藥性＞0.18篩查到的有效成分及通過pubchem、drugbank、chemmapper等數(shù)據(jù)庫(kù)找到藥物的有效成分和靶點(diǎn)情況見表1。

表1 神效瓜蔞散組分的有效成分、預(yù)測(cè)靶點(diǎn)結(jié)果Tab 1 Active ingredients in Shenxiaogualousan and its predicted target results

2.4.2 乳腺癌的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果 乳腺癌通過TTD數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到靶點(diǎn)80個(gè)，通過Pubmed、知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫(kù)文獻(xiàn)查找到41個(gè)靶點(diǎn)，所以乳腺癌的靶點(diǎn)一共121個(gè)。

2.4.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析結(jié)果 通過神效瓜蔞散的有效成分和預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與乳腺癌的靶點(diǎn)匹配后，用Cytoscape軟件構(gòu)建的神效瓜蔞散成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，從圖中可見神效瓜蔞散靠前的靶點(diǎn)是ER、HSP90等，可以推測(cè)神效瓜蔞散通過ER、HSP90等靶點(diǎn)作用于乳腺癌發(fā)揮其抗腫瘤作用。

圖4 神效瓜蔞散的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Target network diagram for Shenxiaogualousan ingredients

2.5 神效瓜蔞散對(duì)ERα作用結(jié)果 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析神效瓜蔞散可能主要通過作用于ER發(fā)揮抗乳腺癌作用，為此筆者檢測(cè)了神效瓜蔞散作用的乳腺癌細(xì)胞SKB的ERα的表達(dá)以驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的預(yù)測(cè)結(jié)果。結(jié)果顯示：加入不同濃度的神效瓜蔞散（0、100、200 μg/mL）后，隨著藥物劑量的增加，ERα逐漸減少（P＜0.05），見圖 5。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)機(jī)制部分吻合。

圖5 神效瓜蔞散對(duì)乳腺癌細(xì)胞SKB的ERα表達(dá)的影響Fig 5 Shenxiaogualousan impact on breast cancer cells of SKB expression of ER alpha

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，神效瓜蔞散能夠在體外抑制乳腺癌細(xì)胞SKBR-3的增殖和遷移，并且呈劑量依賴性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立的成分靶點(diǎn)圖，排在前兩位分別是ER、HSP90。

乳腺癌是世界范圍內(nèi)確診率最高的癌癥，其中75%的乳腺癌是雌激素ER陽(yáng)性，雌激素長(zhǎng)期過度刺激、ER表達(dá)水平增高或轉(zhuǎn)錄激活活性增強(qiáng)，是導(dǎo)致乳腺癌的重要原因[13]，1896年,Beatson醫(yī)生首先對(duì)乳腺癌患者進(jìn)行了卵巢切除術(shù),開創(chuàng)了針對(duì)雌激素治療的先河。如今ER受體已經(jīng)是乳腺癌內(nèi)分泌治療的作用靶點(diǎn)，是乳腺癌治療的主要方法之一，多數(shù)臨床研究結(jié)果顯示內(nèi)分泌輔助治療可以顯著降低乳腺癌復(fù)發(fā)率并延長(zhǎng)生存期。雌激素的生物學(xué)效應(yīng)主要通過雌激素受體介導(dǎo)的對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，雌激素有兩個(gè)受體,ERα與ERβ,研究表明在乳腺中以ERα為主,ERα過度激活是雌激素依賴性乳腺癌發(fā)生與進(jìn)展的重要因素[12]。雌激素的核受體按照結(jié)構(gòu)和功能主要分為2類：類固醇激素受體家族和甲狀腺受體家族，類固醇激素受體未活化狀態(tài)時(shí)與熱休克蛋白結(jié)合存在，配體與受體結(jié)合使熱休克蛋白與受體解離[13]。

熱休克蛋白（HSP）是高度保守的應(yīng)激蛋白，在細(xì)胞中作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、逆轉(zhuǎn)錄許多關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的蛋白水解過程,從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和生存[14-15]。熱休克蛋白通常按照分子量不同，分為HSP70和HSP90，其中HSP90又分為HSP90α和HSP90β兩種亞型，兩者同源性高達(dá)84%，其中HSP90在雌激素的信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用即當(dāng)雌激素受體未與雌激素結(jié)合時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的ER和HSP90形成ER-HSP 90復(fù)合物,雌激素和ER結(jié)合后，HSP90分離,雌激素受體激活發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15]。研究表明，HSP90的過高水平的表達(dá)與乳腺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[16]。

神效瓜蔞散從宋代以來就用來治療乳腺癌，本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮抗乳腺癌作用可能主要是通過內(nèi)分泌通路，今后可以進(jìn)一步研究神效瓜蔞散通過內(nèi)分泌通路治療乳腺癌的具體機(jī)制以及可能存在的其他抗乳腺癌的通路。