優(yōu)化ATP熒光法檢測醫(yī)院次氯酸鈉消毒后物體表面菌落數(shù)的穩(wěn)定性觀察

張博，劉陽，樊海鑫，陳玉，趙小梨，張麗娟，陸紅玲

作者單位：遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563000

ATP熒光法快速檢測細菌總數(shù)是一種以生物發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的檢測方法，該方法檢測菌落總數(shù)便捷、快速、準確，通過該方法能實時監(jiān)測操作流程和生產(chǎn)環(huán)境中微生物含量，可以從源頭避免因細菌總數(shù)超標導(dǎo)致的嚴重后果，因此近些年在多個相關(guān)的行業(yè)領(lǐng)域中都得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是對衛(wèi)生環(huán)境要求嚴格的部門，如醫(yī)院和食品企業(yè)等等。

目前我國大多數(shù)醫(yī)院普遍都是采用消毒液來進行殺菌消毒的，此法成本低，使用范圍廣，目前消毒的效果還是根據(jù)國家標準（GB15982-2012）來進行菌落總數(shù)的培養(yǎng)，此法培養(yǎng)時間長，一般需要48～72 h，但是經(jīng)過長時間的菌落培養(yǎng)等待，被消毒的位置可能菌落總數(shù)早已經(jīng)超標，此時使用ATP熒光法就是對消毒效果是否理想很好的補充檢查。但是外界因素很容易影響熒光法的穩(wěn)定性，造成結(jié)果的不準確，這種結(jié)果的不穩(wěn)定使該方法的應(yīng)用范圍受到了很大的限制［1-6］。

本研究自2018年3—11月在ATP熒光反應(yīng)試劑中加入不同保護成分來增強試劑穩(wěn)定性，以次氯酸鈉（化學(xué)分子式為NaClO）消毒物表做為實驗對象，篩選一種可以明顯降低干擾次氯酸鈉消毒液檢測結(jié)果的試劑，目的是提高ATP熒光法檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，提高其在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器本研究中所用的磷酸二氫鈉，次氯酸鈉等生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自廣東華大技術(shù)有限公司；蛋白純化系統(tǒng)為美國GE公司生產(chǎn)的液相色譜系統(tǒng)AKTA PURIFIER；檢測熒光信號儀器為北京濱松光子技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BHP9505微量光度儀。

1.2試劑制備

1.2.1PBS緩沖液的配制 pH7.8的0.2 mol/L NaH2PO48.5 mL與0.2 mol/L Na2HPO491.5 mL混合。

1.2.2ATP熒光反應(yīng)試劑的制備 熒光素酶0.02mg/mL；D-熒光素0.003 mg/mL；pH7.8的Tris-HCl 50 mmol/L；KCl100 mmol/L；MgCl22 mmol/L；丙三醇（glyercol）10%；聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）1%。溶液配制后用一次性滅菌的0.2–m水系濾膜過濾除菌。

1.2.3消毒試劑的配制 將次氯酸鈉配制成5%的母液備用，使用時將母液現(xiàn)用滅菌蒸餾水1∶100進行稀釋。

1.3反應(yīng)機制基于螢火蟲生物發(fā)光的原理，在有鎂離子存在的條件下，螢火蟲熒光素酶以D-熒光素、ATP、O2為底物，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能并釋放光量子［4］，其發(fā)光強度（I）與ATP濃度（cATP）符合函數(shù)關(guān)系；I＝Imax×cATP/Km+cATP，式中，Imax為最大發(fā)光強度；Km為l×l0-4?？芍?，當cATP遠小于Km時，I正比于樣品中的cATP。因此可通過測定發(fā)光體系的I值來定量ATP濃度［7］。正常條件下細菌體內(nèi)的ATP含量趨近恒定，為10-18mol［8］。以光電倍增管為核心采光部件的光度計都能檢測低于10 pg分子的ATP，這就使快速、準確檢測細菌成為可能［9］。

1.4蛋白純化螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒由美國Cellex公司CEO James惠贈，該質(zhì)粒載體為pET15b-sumo。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21DE3感受態(tài)細胞中，經(jīng)過培養(yǎng)挑取單克隆接菌到LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)4 h后18℃異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導(dǎo)，得到的粗純蛋白質(zhì)經(jīng)過Ni+離子交換純化后，獲得較高純度的螢火蟲熒光素酶。

1.5ATP熒光試劑的成分優(yōu)化ATP熒光法在實際檢測應(yīng)用的過程中非常容易受到外界因素的干擾，比如次氯酸鈉會影響檢測結(jié)果的最低靈敏度和穩(wěn)定性，而次氯酸鈉溶液也經(jīng)常被用在物體表面消毒的過程中。為此我們首先對熒光試劑的成分進行優(yōu)化，在原試劑成分中加入終濃度2 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）和2%硫酸銨來增加熒光反應(yīng)試劑中的蛋白質(zhì)濃度和提高試劑的穩(wěn)定性。

1.6次氯酸鈉消毒后菌落總數(shù)的檢測方法選取一塊1.2 m×2 m的大理石平臺，用0.05%NaClO溶液將無菌衛(wèi)生棉浸濕，擦拭平臺表面，20 min晾干。在72 h內(nèi)分別9次采用平皿法和優(yōu)化前后兩種ATP熒光試劑同時檢測所得到樣品中的細菌總數(shù)。

1.7采樣方法將無菌棉簽用滅菌的PBS緩沖液浸濕，將棉簽在所要檢測的物體表面均勻涂擦，進行細菌采集，采樣面積為10 cm×10 cm，將取樣后的棉簽頭部剪掉手接觸部分再次放入裝有1mLPBS滅菌的EP管中渦旋搖晃洗滌數(shù)次，即得到物體表面菌樣。將得到的菌樣進行菌落總數(shù)（CFU）和相對發(fā)光值（RLU）檢測，以CFU和RLU值做結(jié)果分析。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0進行分析，P＜0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1次氯酸鈉消毒后熒光法檢測與菌落總數(shù)相關(guān)性經(jīng)消毒劑擦拭晾干后，平皿法檢測的結(jié)果是沒有任何細菌，但采用優(yōu)化前ATP熒光試劑檢測結(jié)果卻顯示出一定的光值，在隨后的72 h，平皿法檢測結(jié)果隨著時間的增加，細菌總數(shù)隨之增加，但熒光法檢測在24 h內(nèi)的檢測結(jié)果沒有規(guī)律，24 h后隨著時間的變化，熒光值（RLU）與細菌總數(shù)（CFU）有一定的相關(guān)性（圖1，2）。因此，當被檢樣品細菌數(shù)較少時，檢測結(jié)果受次氯酸鈉的影響較大，但隨著次氯酸鈉的不斷降解和細菌總數(shù)的增加，次氯酸鈉對熒光法檢測結(jié)果的影響逐漸變小。優(yōu)化后的熒光試劑檢測的結(jié)果則與平皿法檢測的結(jié)果有一定的相關(guān)性（圖3）。

圖1 次氯酸鈉消毒后的物表72 h菌落總數(shù)變化曲線

圖2 次氯酸鈉消毒后的物表72 h熒光值變化曲線

圖3 優(yōu)化后的熒光試劑檢測次氯酸鈉消毒后的物表72 h熒光值曲線

2.2次氯酸鈉消毒后熒光法菌落總數(shù)標準曲線的建立我們再次通過對醫(yī)院50張辦公桌和50位工作人員的手共100個樣品采用次氯酸鈉溶液進行消毒，經(jīng)過5 h后，采用國標平皿法和ATP熒光法兩種方法同時進行檢測，將平皿法檢測菌落總數(shù)（CFU）和熒光法檢測熒光值（RLU）的兩組數(shù)據(jù)進行線性擬合，建立標準曲線（圖4），得出公式（1）：y＝0.062 7x+12.453（R2＝0.962 5），說明在次氯酸鈉消毒后的的物體表面經(jīng)過一段時間后其菌落生物發(fā)光值與菌落總數(shù)存在著線性相關(guān)關(guān)系。

圖4 ATP熒光法檢測次氯酸鈉消毒后表面的菌落總數(shù)標準曲線

2.3次氯酸鈉消毒后熒光法與菌落總數(shù)的檢測我們再次用相同的方法選取醫(yī)院30處不同潔凈程度的物體表面（用次氯酸鈉溶液消毒）。把熒光法檢測得到的RLU值帶入公式（1），推算出CFU值（菌落總數(shù)預(yù)測值），再將平皿法測得的CFU值（菌落總數(shù)實際值）和菌落總數(shù)預(yù)測值（表1），用SPSS軟件進行顯著性和相關(guān)性分析，結(jié)果表明當經(jīng)過次氯酸鈉溶液擦拭過的物表再次采用熒光法檢測時，平皿法檢測出的實際CFU值與熒光法推測的CFU預(yù)測值在P＜0.01水平上呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r＝0.985。即優(yōu)化后的ATP熒光試劑在檢測次氯酸鈉溶液擦拭后的物體表面的結(jié)果與國標平皿計數(shù)法基本一致，可以用此方法對次氯酸鈉消毒后的物體表面清潔度進行半定量的判斷。

表1 30處不同潔凈程度的物體表面次氯酸鈉消毒后的菌落總數(shù)預(yù)測值與實際推算值

醫(yī)院消毒標準-國標（GB15982-2012）規(guī)定1 cm2的面積CFU≤5.0，本實驗的采樣面積為10 cm×10 cm，所以檢測標準設(shè)定為500 CFU，我們根據(jù)熒光法推導(dǎo)出的CFU結(jié)果與平皿法檢測的結(jié)果進行比對，并參考國標（GB15982-2012），發(fā)現(xiàn)當RLU值低于7 000時，無論熒光法計算出的菌落總數(shù)CFU和平皿法實測的菌落總數(shù)CFU結(jié)果均小于450，當RLU高于8 000時，對應(yīng)CFU的結(jié)果均高于550，所以我們將光值RLU低于7 000設(shè)定為清潔；RLU高于8 000設(shè)定為污染；RLU光值7 000～8 000設(shè)定為警告，需要進一步檢測（表2）。

表2 醫(yī)院消毒半定量標準

根據(jù)表2的判斷標準，我們隨機在醫(yī)院檢測了次氯酸鈉消毒后的護理托盤、醫(yī)護人員的雙手、辦公桌面。由兩個人分別各自采用一種方法進行雙盲實驗進行驗證。結(jié)果顯示當平皿法檢測結(jié)果細菌超標時，熒光法測得的RLU值按照表2中設(shè)定的結(jié)果同樣為超標。當平皿法檢測的結(jié)果為合格時，熒光法測得的光值同樣低于設(shè)定污染的光值。驗證試驗共檢測15個樣品，其中平皿法測得12個為合格樣品，不合格樣品3個。熒光法測得11個為合格樣品，3個為不合格樣品，1個為警告（表3）。該結(jié)果表明該方法改進后可以對經(jīng)過次氯酸鈉消毒液擦拭后的物體表面細菌總數(shù)的多少作出半定量的判斷。

表3 兩種方法15組盲測結(jié)果對比

3 討論

目前國標法細菌總數(shù)測定采用的是平皿法，工作量大，等待時間長，所以大大降低了工作效率，而且對于營養(yǎng)富集的檢測樣品不能做到實時監(jiān)測，過長的檢測時間會造成細菌的大量增長，如果通過熒光法對樣品進行半定量的測定，快速的給出樣品合格、警告、不合格的參考，則可以快速提高工作效率和避免因檢測結(jié)果時間過長造成細菌超標的危害［8，10］。

ATP熒光法的酶促反應(yīng)對外界干擾較為敏感，而目前市場中常用的消毒液種類繁多，每一種消毒液對反應(yīng)的光值均有不同程度的影響，所以限制了該方法在醫(yī)院中的應(yīng)用。我們通過調(diào)研多家三甲醫(yī)院，發(fā)現(xiàn)所使用的消毒液主要成分為次氯酸鈉，所以我們將其作為首選并對檢測試劑進行了優(yōu)化，克服了在低靈敏度時次氯酸鈉消毒液對檢測結(jié)果的影響，并初步建立了檢測標準。不同的醫(yī)院或部門可以根據(jù)環(huán)境衛(wèi)生的要求單獨對檢測標準細化，如清潔、基本清潔、警告、污染、重度污染等。另該方法的檢測結(jié)果RLU光值能直接由儀器讀出，并對檢測結(jié)果進行不同等級的劃分，直接為使用部門提供半定量的檢測結(jié)果，避免了檢測前需要建立標準曲線等一系列復(fù)雜的換算過程，既為日常的檢測節(jié)約了時間，又便于檢測人員的使用。本實驗選取了較為常見的次氯酸鈉消毒樣品來進行實驗，為熒光試劑在醫(yī)院領(lǐng)域大范圍的應(yīng)用提供參考，但該試劑優(yōu)化后仍然對市場上其他大部分消毒液種類不具備普遍性，因此我們也在不斷的進行后續(xù)的實驗，力爭早日研發(fā)出更為穩(wěn)定、適應(yīng)性更廣泛的熒光快速檢測試劑。