自噬相關蛋白LC3和E-鈣黏蛋白、波形蛋白在子宮內膜異位癥中的表達

代小燕，邸石，靖芳

作者單位：武漢市第三醫(yī)院婦產科，湖北 武漢 430061

子宮內膜異位癥（內異癥）是不孕癥和慢性盆腔疼痛的常見原因，其特征是子宮內膜腺體和間質的子宮腔外生長，近年來發(fā)病率呈明顯上升趨勢。內異癥雖是良性疾病，但具有類似惡性腫瘤廣泛種植及侵襲生長能力的生物學行為。黏附-侵襲-血管生成是子宮內膜異位癥異位種植發(fā)生病變的基本病理生理過程［1］。已有研究表明，自噬廣泛參與腫瘤的侵襲轉移過程，并對上皮間質轉化（EMT）的發(fā)生進行調控［2］。本研究旨在探討自噬相關蛋白LC3以及和EMT相關的E-鈣黏附蛋白（E-cadherin），波形蛋白（Vimentin）在子宮內膜異位癥病人異位及在位子宮內膜組織中的表達情況，探討其與子宮內膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2018年1—11月在武漢市第三醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術治療的41例卵巢子宮內膜異位癥合并有子宮腺肌病，因病變廣泛、痛經癥狀進行性重，保守治療無效且無生育要求而行全子宮切除術病人，術中留取在位子宮內膜及異位子宮內膜，分為在位內膜組和異位內膜組，平均年齡（39±3.5）歲；選取同期38例因子宮肌瘤行全子宮切除術病人為對照組，術中留取正常子宮內膜，為正常內膜組，平均年齡（41±2.3）歲。各組病人在年齡上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。選取病人均有規(guī)律的月經周期，術前至少6個月未服用任何激素類藥物，無其他內分泌及內外科合并癥。在增殖期收集子宮內膜標本，臨床診斷均以術后病理結果為準。該實驗在標本采集前均告知并簽署知情同意書，本研究的倫理批準來自湖北省武漢市第三醫(yī)院倫理委員會（武三醫(yī)倫KY2018-013）。

1.2子宮內膜組織中LC3B、E-cadherin和Vimentin表達檢測將新鮮手術標本在10%甲醛中固定24 h，然后包埋在石蠟塊中。將甲醛固定和石蠟包埋的子宮內膜組織切成5 μm，并安裝在經乙醇清潔的載玻片上。經過脫蠟、脫苯、水化后采用SP法檢測LC3、E-cadherin和Vimentin表達，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司，步驟參照試劑盒說明書。每張切片隨機取20個高倍鏡（×200）視野，每個視野計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)，無細胞著色為（-），陽性細胞數(shù)百分比＜25%（+）、26%～50%（++）、51%～75%（+++）、＞76%（++++），+～++++均記為陽性表達，計算陽性表達率。分析子宮內膜組織中LC3、E-cadherin和Vimentin表達的相關性。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 子宮內膜異位癥41例和子宮肌瘤38例代表性的染色實例（免疫組織化學染色）

2 結果

運用免疫組織化學染色檢測LC3、E-cadherin和Vimentin的表達，代表性的染色實例見圖1。LC3定位在腺上皮細胞和基質細胞的細胞質內；E-cadherin定位于兩種細胞的細胞膜和細胞質；Vimentin定位于基質細胞的細胞質。異位子宮內膜組中LC3的陽性表達率顯著高于正常子宮內膜組和在位子宮內膜組（P＜0.05），LC3的陽性表達率在正常子宮內膜組和在位子宮內膜組中差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；異位子宮內膜組和在位子宮內膜組中E-cadherin陽性表達率均低于正常內膜組（P＜0.05）；異位子宮內膜組和在位子宮內膜組中Vimentin陽性表達率均高于正常內膜組（P＜0.05）。異位內膜組中自噬相關蛋白LC3與E-cadherin表達呈負相關（r＝-0.627，P＜0.05），LC3 和 Vimentin（r＝0.537，P＜0.05）表達呈正相關，E-cadherin與 Vimentin（r＝-0.615，P＜0.05）表達呈負相關。各組LC3、E-cadherin和Vimentin陽性表達率比較見表1。

表1 子宮內膜異位癥41例和子宮肌瘤38例各組LC3B、E-cadherin和Vimentin表達比較/例（%）

3 討論

子宮內膜異位癥是育齡女性的常見病及難治病，嚴重影響女性健康和生活質量。Sampson的經血逆流學說是內異癥經典理論，但不能解釋90%的經血逆流發(fā)生率，而只有10%～15%女性發(fā)生內異癥的現(xiàn)象。子宮腔外子宮內膜組織的遷移，侵襲和血管生成是子宮內膜異位癥進展的關鍵步驟［3］。子宮內膜異位癥是一種多因素疾病，其發(fā)病機制一直是婦科基礎與臨床研究的熱點，迄今為止，內異癥發(fā)病機制仍不明確。

自噬是一種高度保守的細胞行為，是細胞應對營養(yǎng)缺乏、缺氧、感染等惡劣環(huán)境因素的生存機制之一，其可通過降解胞質內受損細胞器，產生氨基酸與游離脂肪酸以供蛋白質和能量的合成，其通過維持腫瘤細胞在代謝應激環(huán)境下存活來促進轉移進程［4］。已有有研究表明，自噬廣泛參與腫瘤的侵襲轉移過程，并對EMT的發(fā)生進行調控［5］。自噬能夠激活EMT促進肝癌細胞的侵襲：TGF-β1作為EMT發(fā)生最重要的誘導因子，能夠激活自噬；而自噬激活可使肝癌細胞的TGF-β1表達水平顯著上升，進一步使肝癌發(fā)生EMT與獲得侵襲轉移表型，從而形成正反饋的循環(huán)效應［6］。已知LC3（酵母Atg8的哺乳動物同源物）存在于自噬體上，并且LC3 I-II的轉化是監(jiān)測該過程的廣泛使用的標志物［7］，因此LC3的表達強度與自噬活性密切相關。近年來，科學家們發(fā)現(xiàn)自噬與子宮內膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，有研究表明，自噬在卵巢子宮內膜異位癥中被上調，并且可能有助于子宮內膜異位細胞的存活和異位部位的病變維持［8］。然而，關于子宮內膜異位癥中自噬的表達水平存在爭議性結果，Choi及其同事報道，異位內膜中的自噬水平降低，同時p70S6K磷酸化的激活（mTOR激活的特征）［9］。

EMT是指在某些特殊的生理或病理條件下，上皮細胞在形態(tài)學上發(fā)生向間質細胞表型的轉變并獲得遷移能力的過程［10］。上皮細胞標志物如ECadherin表達下調或缺失是EMT的最重要的標志性變化，也是上皮腫瘤細胞侵襲的前提條件［11］。間質表型標志物Vimentin是間質細胞中最主要的中間纖維，其表達升高是導致E-Cadherin表達缺失的原因之一，同時會干擾E-Cadherin介導的細胞黏附作用?；贓MT的發(fā)生發(fā)展與內異癥異位種植和轉移的生物學特征相契合，近年來EMT與內異癥發(fā)病的關系引起學者們的廣泛關注［12］。EMT失衡可能是導致子宮內膜異位性疾病發(fā)生的機制之一，有研究證實在異位內膜中EMT的發(fā)生在促進內異癥異位子宮內膜細胞的侵襲和轉移中扮演重要角色［13］。

本研究通過免疫組化SP法檢測LC3和EMT相關蛋白E-cadherin、Vimentin在正常子宮內膜、在位子宮內膜及異位子宮內膜中的表達情況，并做相關性分析。本研究結果顯示，以正常子宮內膜作為對照，子宮內膜異位癥病人異位子宮內膜組中LC3的陽性表達率顯著高于正常子宮內膜組和子宮內膜異位癥病人在位子宮內膜組（P＜0.05），且異位內膜組中E-cadherin表達陽性率明顯低于正常子宮內膜中E-cadherin表達陽性率（P＜0.05），異位內膜上皮細胞中Vimentin的表達陽性率明顯高于正常內膜上皮細胞中Vimentin的表達陽性率（P＜0.05），在異位內膜組中，三者表達具有相關性。總之，在異位子宮內膜組織中，自噬表達水平上調伴有EMT現(xiàn)象的發(fā)生。我們推測，自噬表達上調可能促進異位子宮內膜組織上皮細胞EMT的形成，從而促進異位子宮內膜的黏附、侵襲和轉移，最終導致異位病灶的發(fā)生、發(fā)展，抑制自噬可能作為預防和治療子宮內膜異位癥的新靶點，但其確切的機制有待深入探討。