檢測牛奶和水中卡那霉素殘留物的電化學(xué)適配體傳感器研究進展

李鳳琴，俞志剛＊，韓賢達，石文兵

（1．長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院無機特種功能材料重慶市重點實驗室博士后科研工作站，重慶涪陵408100；2．哈爾濱理工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040）

1 概述

卡那霉素是一種氨基糖苷類抗生素，它廣泛應(yīng)用于治療革蘭陽性和革蘭陰性菌引起的嚴重感染，在畜牧業(yè)中常作為獸藥來使用［1］。與其他抗生素類獸藥一樣，卡那霉素的普遍應(yīng)用造成了不同基質(zhì)，尤其是牛奶和水中存在一定的殘留［2－4］。經(jīng)常飲用和食用含有卡那霉素的飲品和食品，會導(dǎo)致其累積從而對人體產(chǎn)生嚴重的毒副作用，如失聰、傷腎、藥物過敏和耐藥性等［5－9］。因此，開發(fā)快速而準確的卡那霉素殘留檢測技術(shù)，實現(xiàn)其有效監(jiān)控，對確保食品和環(huán)境安全進而保障人們健康具有重要意義。

近年來，適配體及其篩選技術(shù)因顯示出特異性高、親和力強、結(jié)合靶標范圍寬、易于合成和穩(wěn)定性好等優(yōu)點得到了蓬勃發(fā)展，在生化分析等領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注，基于適配體的生物傳感技術(shù)成為當前農(nóng)獸藥殘留新型檢測技術(shù)的前沿研究熱點之一［10－12］。作為一類重要的適配體生物傳感技術(shù)，電化學(xué)適配體傳感器具有器件組裝成本低、操作簡單、免樣品前處理、可便攜式和易于實現(xiàn)現(xiàn)場監(jiān)測等特點，是未來發(fā)展的重要方向之一［13－14］。

本文對近5年采用電化學(xué)適配體傳感器方法檢測牛奶和水中卡那霉素殘留的相關(guān)研究進行綜述，揭示當前該技術(shù)的研究現(xiàn)狀、優(yōu)勢、局限性和所存在的問題，并對未來的發(fā)展趨勢進行展望。

2 電化學(xué)適配體傳感技術(shù)

2．1 適配體簡介

適配體（Aptamer）一詞最初源于拉丁語“Aptus”，原指為一種可與靶標物質(zhì)高度契合的聚合物［15］。適配體在本質(zhì)上是指通過人工合成的可高特異性和高親和力結(jié)合靶標物質(zhì)的一段單鏈寡聚核苷酸（DNA和RNA）或肽的片段，其與靶標物質(zhì)的作用類似于抗原－抗體之間的作用［16］。作為已經(jīng)被證明是一類傳感器應(yīng)用中重要而有效地分子識別物質(zhì)，與其他分子識別物質(zhì)相比，適配體顯示出5個方面的突出優(yōu)點［17］：（1）高的特異性與親和力；（2）可結(jié)合靶標物質(zhì)范圍寬；（3）易于通過化學(xué)合成和體外篩選獲得；（4）分子量小；（5）穩(wěn)定性和可重復(fù)性好。以上優(yōu)點使適配體在構(gòu)建電化學(xué)傳感器的應(yīng)用上成為理想的生物接收器［18－20］。

2．2 傳感器分類與結(jié)構(gòu)

電化學(xué)技術(shù)被廣泛地用于食品和水中污染物的檢測［21－25］。因該技術(shù)檢測成本低、操作簡單快速、抗污染能力強、易微型化和實現(xiàn)在線監(jiān)測，具有極好的應(yīng)用化和商業(yè)化前景，與其他技術(shù)相比，顯示出明顯的優(yōu)勢。根據(jù)輸出參數(shù)，如阻抗、電流和電位，電化學(xué)適配體傳感器一般可對應(yīng)分為三種類型，即阻抗型傳感器、電流型（安培／伏安）傳感器和電位（電勢）型傳感器。電化學(xué)檢測技術(shù)與適配體篩選技術(shù)相結(jié)合，極大地促進了適配體傳感器的發(fā)展，為解決復(fù)雜基質(zhì)樣品中各類污染物分析提供了可行解決方案［26－30］。

電化學(xué)適配體傳感器主要由敏感分子識別元件和轉(zhuǎn)換器兩部分組成。轉(zhuǎn)換器部件一般又分為修飾層、電極基底和電學(xué)系統(tǒng)三部分。用作修飾層的物質(zhì)，如有機分子、導(dǎo)電聚合物和納米材料等起著適配體和基底的連接作用，可有效改善電子傳遞效率實現(xiàn)電信號的擴增。用作基底的一般是由不同材料做成的電極，如Au電極、玻碳電極（GCE）、銦錫氧化物電極（ITO）和固體聚合物電極（SPE）等。電學(xué)系統(tǒng)通常包括一個信號擴增器、處理器和顯示設(shè)備，其中檢測技術(shù)最為重要。敏感分子識別元件又稱為生物接收器，其依靠適配體與目標物進行作用，作用大小由轉(zhuǎn)換器測量并輸出為可測電信號，該信號與目標物濃度成比例關(guān)系，進而顯示出目標物在樣品中的存在水平，實現(xiàn)定量檢測［31－32］。

2．3 電化學(xué)檢測技術(shù)

2．3．1 差分脈沖伏安法（DPV） DPV法被認為是線性掃描伏安法和階梯掃描伏安法的衍生方法。具體做法是在電勢線性掃描和階梯掃描上施加一系列常規(guī)脈沖電壓，且在電勢改變之前完成電流測定。在DPV法中由于所測電流為電解電流和電容電流之和，且采用電流差值方式對電勢作圖，可有效減小背景電流中電容電流和雜質(zhì)氧化還原電流的干擾，因而利于獲得高的靈敏度和低的檢出限，同時易于在一次掃描中對具有不同氧化還原電勢的多種物質(zhì)實現(xiàn)同時檢測，在傳感器構(gòu)建中常被用作定量檢測技術(shù)，獲得了廣泛應(yīng)用。盡管該方法具有明顯優(yōu)點，但在復(fù)雜基質(zhì)中，由幾種電活性物質(zhì)產(chǎn)生的對電流響應(yīng)的電勢干擾仍難以消除［33］。

2．3．2 方波伏安法（SWV） SWV法的本質(zhì)是一種極譜分析方法。實驗方法是在通常的、緩慢改變的直流電壓上疊加一個低頻率和小振幅的方形波電壓，在方波電壓方向變化前一瞬間記錄通過電解池的交流電流。因該方法在充電電流消失時刻開始記錄電流，可有效消除充電電流的干擾，獲得高的檢測靈敏度。與DPV法一樣，SWV法也是傳感器構(gòu)建中最常用的定量檢測技術(shù)之一［34－35］。

2．3．3 交流伏安法（ACV） ACV法是一種疊加交流電的伏安法。實驗方法是在工作電極上施加一個隨時間慢掃描的直流電勢Edc，并疊加峰－峰值為5mV的正弦波交流成分Eac。測量電流的交流成分的幅值和相對于Eac的相角，得到相應(yīng)的交流伏安圖。圖中存在明確的電流峰，其大小與溶液中電活性物質(zhì)的濃度成正比。由于該方法有效消除了充電電流的干擾，濃度測量精度可達10－7mol／L數(shù)量級，適合于定量檢測，同時也常用于測量電極反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)和研究反應(yīng)機理［36］。

2．3．4 電化學(xué)阻抗譜法（EIS） EIS法是電化學(xué)暫態(tài)技術(shù)的一種。常用的是正弦波交流阻抗技術(shù)。實驗方法是通過控制電極電流（或電極電勢）使其按正弦波規(guī)律隨時間小幅度變化，同時測量作為其響應(yīng)的電極電勢（或電流）隨時間的變化規(guī)律。在具體應(yīng)用中，該方法是通過探測溶液體系中電極／電解液界面性質(zhì)的特征變化感知電極表面生物分子復(fù)合物的形成［37］。通常情況下，該技術(shù)比其他電化學(xué)暫態(tài)技術(shù)更易給出電極界面和電極過程動力學(xué)的各種參數(shù)，同時可以用來對即時發(fā)生的兩或多個電化學(xué)反應(yīng)進行識別并對如通過鈍化膜擴散發(fā)生的擴散限制反應(yīng)進行鑒定。它還可以用來對使用自身電極的組裝器件成分進行檢測并提供相關(guān)的電極轉(zhuǎn)移反應(yīng)速率信息。近年來，隨著阻抗適配體傳感器的發(fā)展，這一信號輸出技術(shù)顯示出許多顯著的優(yōu)點，如受基質(zhì)干擾效應(yīng)小、檢測范圍寬、穩(wěn)定性高和易于實現(xiàn)自動化［38］。

3 卡那霉素電化學(xué)適配體傳感器研究進展

近5年來，隨著適配體篩選技術(shù)的發(fā)展和卡那霉素適配體的報道，采用核酸適配體為分子識別元件的電化學(xué)卡那霉素適配體傳感器的研究引起了人們廣泛關(guān)注，具體參數(shù)總結(jié)對比列于表1，分別為采用DPV、SWV、ACV和EIS四種電化學(xué)測量技術(shù)對牛奶和水中的卡那霉素殘留進行了檢測。獲得的檢測限介于1．3fmol／L～8．6nmol／L之間，普遍低于我國農(nóng)業(yè)部235號公告［57］《動物源性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定的抗生素最大殘留限定范圍1～100ng／g（約為1～100nmol／L），以及歐盟法規(guī)標準《歐盟食品中獸藥殘留限量標準》（EC470／2009）［58］，傳感響應(yīng)時間多數(shù)介于30～120min之間。

表1 牛奶和水中卡那霉素檢測電化學(xué)適配體傳感器參數(shù)對比一覽表Table 1 Data sheet of parameter comparison of reported electrochemical aptasensors for the detection of kanamycin in milk or water

3．1 電流型適配體傳感器

3．1．1 基于DPV技術(shù) 基于DPV檢測技術(shù)，研究人員設(shè)計了多種精妙方案以大幅度降低對目標物卡那霉素的檢測限，進而提高傳感器靈敏度，其中最為有效的當屬多重循環(huán)信號擴增策略的應(yīng)用。Feng等［48］將雜交鏈式反應(yīng)（HCR）和立足點介導(dǎo)鏈取代反應(yīng)（TMSTR）結(jié)合，實現(xiàn)了對目標物雙重信號擴增檢測，其檢測限值低至16fmol／L。該方法先將S1／S2雜交探針和S3分別自組裝在Au電極E－1和E－2表面，其中S1和S2雜交形成S1／S2雙鏈結(jié)構(gòu)。S2中間為適配體堿基序列，兩邊為立足點序列T1和T2。T1和T2可驅(qū)動目標物循環(huán)和雜交鏈式反應(yīng)。加入卡那霉素后，其與S2反應(yīng)生成復(fù)合物并游離于溶液體系，然后在T1介導(dǎo)下復(fù)合物中的S2與S3發(fā)生雜交同時將卡那霉素釋放進行下一循環(huán)，從而實現(xiàn)一級信號擴增。生成的S2／S3雙鏈上暴露的T2可驅(qū)動雜交鏈式反應(yīng)形成長雙鏈結(jié)構(gòu)因可結(jié)合更多的亞甲基藍（MB）指示劑而實現(xiàn)二級信號擴增。雙級信號擴增的實現(xiàn)是該傳感器高靈敏度的主要原因。

Wang等［45］將目標物引發(fā)多重循環(huán)信號擴增的方法引入到傳感器的構(gòu)建中。其方法是：在目標物第一分子卡那霉素的存在下，莖環(huán)型探針HP1打開誘發(fā)酶輔助目標物循環(huán)擴增反應(yīng)的發(fā)生，同時自發(fā)引起第二分子卡那霉素的生成。第二分子卡那霉素不僅可以跟HP1雜交且可取代電極上的Helper探針，結(jié)果導(dǎo)致標記MB的HP2探針形成封閉型結(jié)構(gòu)，將MB拉近電極表面，電子傳遞效率大幅度提高，獲得了檢測限低至1．3fmol／L的超高靈敏度。

近年來，納米材料如碳納米管（CNTs）、石墨烯（GR）、導(dǎo)電聚合物（CPs）和金屬納米粒子（MNPs）等，以及其復(fù)合材料因具有比表面積高、生物兼容性好、導(dǎo)電效率高和獨特的物理化學(xué)特性等優(yōu)點，在改善電極表面電子傳遞效率方面表現(xiàn)優(yōu)異，越來越多地被應(yīng)用于適配體傳感器的制備中［59－64］。Guo［43］以MWCNTs、1－丁基－3－甲基六氟磷酸鹽咪唑鎓離子液體和納米孔PtTi（NP－PtTi）合金復(fù)合材料修飾GCE，構(gòu)建了基于適配體的卡那霉素傳感器。以DPV法為定量信號測量技術(shù)，在優(yōu)化條件下，對卡那霉素檢測的線性范圍為0．05～100ng／mL，獲得的檢測限為3．7pg／mL。Xu等［41］則采用了石墨烯－聚苯胺（GR－PANI）和聚酰胺－胺型樹枝狀高分子功能化的AuNPs（PAMAM－Au）復(fù)合材料，同時借助HRP對H2O2的酶催化反應(yīng)，獲得了對卡那霉素4．6pg／mL的檢測限。該傳感器在構(gòu)建上先分別用GR－PANI和PAMAM－Au滴涂在GCE表面，再依靠靜電吸附作用將卡那霉素抗體固定，最后用牛血清白蛋白（BSA）和10個堿基的A序列即Poly（A）10混合溶液封閉電極。在信號機制上采用了夾心型結(jié)構(gòu)形成結(jié)合酶催化的信號轉(zhuǎn)換方式：在卡那霉素存在時，抗體與卡那霉素結(jié)合，HRP標記的鏈霉親和素和修飾適配體的生物素結(jié)合，并通過適配體與卡那霉素作用以三明治結(jié)構(gòu)耦合在電極表面，在H2O2體系中借助HRP的催化作用產(chǎn)生高的催化電流；相反，在無卡那霉素的情況下，耦合作用無法發(fā)生，催化電流低。作為高效的電流信號擴增反應(yīng)方式，酶催化引入傳感信號機制利于獲得高的靈敏度，但同時也存在對實現(xiàn)條件要求苛刻而產(chǎn)生的檢測不穩(wěn)定缺陷，不利于在實際復(fù)雜樣品體系中的應(yīng)用。

3．1．2 基于SWV技術(shù) 基于SWV檢測技術(shù)，Xu等［52］在傳感器構(gòu)建中引入核酸外切酶，并借助其循環(huán)剪切作用實現(xiàn)了對卡那霉素低至1pmol／L檢測限的超靈敏檢測。該傳感器信號機制為：加入卡那霉素之前，適配體互補DNA（cDNA）的巰基化5′端通過Au－S鍵嫁接于電極表面，并與適配體以完全互補雜交雙鏈存在。加入核酸外切酶，因其剪切作用引發(fā)cDNA的自消化并釋放適配體，被釋放的適配體開始第二輪剪切過程，并循環(huán)進行至電極表面所有cDNA自消化完畢。此時殘余cDNA很短，釕離子吸附量少，電子傳遞效率低，獲得背景電流??；加入卡那霉素后，因其與適配體結(jié)合形成適配體／卡那霉素復(fù)合物從而抑制了適配體與cDNA的雜交，核酸外切酶不起作用，電極表面cDNA長度不變，釕離子吸附量變大，電子傳遞效率增高，檢測電流增強。該傳感體系因借助核酸外切酶的循環(huán)剪切作用實現(xiàn)了背景信號的大幅度壓縮，利于相對增大響應(yīng)信號變化絕對值而獲得較高的傳感靈敏度。Chen等［53］建立了同時檢測卡那霉素和四環(huán)素的分析方法。該傳感器在構(gòu)建上先將分別負載Cd2＋和Pb2＋的金屬有機框架材料（MOFs）分別與卡那霉素適配體和四環(huán)素適配體結(jié)合，形成兩目標物的示蹤信號探針（分開的出峰電流示蹤各自的電流信號），然后利用anti－ssDNA抗體與適配體DNA之間的特異性作用將兩示蹤信號探針混合嫁接于免疫磁珠表面從而構(gòu)筑成混合型適配體傳感器；在信號機制上借助RecJf核酸外切酶催化目標物的循環(huán)擴增方法：在加入卡那霉素和四環(huán)素之前，因磁珠表面布滿示蹤信號探針背景電流信號高；加入兩目標物后，因適配體與各自目標物反應(yīng)導(dǎo)致示蹤信號探針與磁珠分離，同時RecJf核酸外切酶將適配體剪切釋放目標物實現(xiàn)第一次循環(huán)，釋放出的目標物可激發(fā)下一循環(huán)的發(fā)生，循環(huán)往復(fù)以實現(xiàn)對磁珠表面示蹤信號探針的無限次循環(huán)剪切，從而獲得超低的檢測電流。利用該方法傳感器對兩種目標物獲得了較低的檢測限，對卡那霉素為0．15pmol／L，對四環(huán)素為0．18pmol／L。同時，該課題組在該工作基礎(chǔ)上又借助核酸內(nèi)、外切酶作用實現(xiàn)了雙循環(huán)信號的擴增，并用于卡那霉素和氯霉素的同時檢測，獲得了較高的靈敏度，對兩目標物的檢測限分別為35fmol／L和21fmol／L［54］。

3．1．3 基于ACV技術(shù) 基于ACV檢測技術(shù)，本課題組［55］建立了基于信號探針轉(zhuǎn)移機制的傳感器用于牛奶、水和血清中卡那霉素殘留物檢測。如圖1所示，在信號機制上采用了目標物誘導(dǎo)信號探針轉(zhuǎn)移的方式：加入卡那霉素之前，捕獲探針與輔助探針以雙鏈的“單撐式”結(jié)構(gòu)存在，因信號探針游離于溶液體系中，標記指示劑亞甲基藍（MB）遠離電極表面，電子傳遞效率低，背景電流?。欢尤肟敲顾睾螅敲顾乇徊东@探針捕獲，取代輔助探針與捕獲探針反應(yīng)形成捕獲探針／卡那霉素莖結(jié)狀復(fù)合物，釋放后的輔助探針與游離于溶液中的信號探針雜交成雙鏈結(jié)構(gòu)將MB拉近至電極表面，電子傳遞效率增大，檢測電流升高。該體系因信號探針的游離而獲得了超低的背景信號，利于獲得高的靈敏度，對卡那霉素的檢測限低至3．3 pmol／L，同時獲得了較快的傳感速度。

3．2 阻抗型適配體傳感器

圖1 基于目標物誘導(dǎo)信號探針轉(zhuǎn)移機制的適配體傳感器工作示意圖［55］Fig．1 Working schematic diagram of aptamer sensor based on target－induced signaling probe shifting mechanism［55］

基于EIS檢測技術(shù)，Sharma研究組［56］構(gòu)建了一次性便攜式的阻抗適配體傳感器用于牛奶中卡那霉素的檢測。在信號機制上采用了阻抗增強的方式：加入目標物之前，電子傳遞效率高，阻抗?。患尤肽繕宋锖?，適配體特異性捕獲目標物形成復(fù)合物覆蓋在電極表面，阻礙了電子傳遞通道，阻抗增大。阻抗變化與目標物濃度相關(guān)。在優(yōu)化條件下，該傳感器對目標物檢測獲得了1．2～75ng／mL的線性范圍和0．11ng／mL的檢測限。以鏈霉素（Streptomycin）和慶大霉素（gentamicin）為參照干擾物，顯示出對卡那霉素較好的選擇性，同時以牛奶為實際樣品對該方法進行加標回收率考察，獲得回收率為96．88%～100．5%（RSD＝4．56%，n＝3）的較好結(jié)果。

4 結(jié)語

對已有適配體卡那霉素研究成果綜述分析表明，隨著適配體篩選技術(shù)和電化學(xué)、光學(xué)等多種檢測技術(shù)，以及各種納米及其復(fù)合材料的發(fā)展與聯(lián)合，精妙的傳感設(shè)計不斷涌現(xiàn)，基于卡那霉素適配體的傳感器獲得了較好的發(fā)展，但仍然停留在理論和實驗室研究階段，距離實際應(yīng)用化的路還很長，關(guān)鍵問題仍有待解決和完善，主要體現(xiàn)在如下三方面：（1）提高靈敏度：文獻所報道傳感器的檢測限盡管大部分都很低，可滿足實際樣品檢測限的要求，但都是在純緩沖溶液體系中得到，受基質(zhì)干擾影響，在實際復(fù)雜樣品中會有明顯降低。這些傳感器的靈敏度仍有待提高；大部分文獻之所以獲得了較高靈敏度，均借助了酶促反應(yīng)實現(xiàn)信號擴增或采用納米材料進行電極修飾以提高電子傳遞效率，由于操作條件苛刻和不穩(wěn)定，在實際復(fù)雜基質(zhì)樣品中不易獲得良好的表現(xiàn)，難以應(yīng)用化。因此，開發(fā)無酶無納米材料修飾的高靈敏度傳感器是實現(xiàn)應(yīng)用化的客觀要求；（2）改善特異性：傳感器對靶分子的特異性在很大程度上由所用適配體對靶分子的特異性所決定。受篩選時的實驗誤差和所構(gòu)建傳感器的傳感環(huán)境與適配體篩選時實際化學(xué)環(huán)境的差異以及報道結(jié)果的主觀因素等多方面影響，傳感器的特異性表現(xiàn)往往并不完美。通過優(yōu)化所構(gòu)建傳感器的結(jié)構(gòu)進一步改良特異性是期待解決的問題；（3）提高傳感速度：已報道的傳感器響應(yīng)速度慢，普遍介于30～120min，考慮到實際應(yīng)用時其他必要步驟的消耗，完整檢測過程耗時長，不利于建立現(xiàn)場快速監(jiān)測方法，有待改進。

有理由相信，通過科研工作者的不懈努力，制約傳感器發(fā)展的瓶頸問題必定會逐步解決，設(shè)計和構(gòu)建具有實際商業(yè)化價值的快速、準確和便攜式電化學(xué)適配體傳感器設(shè)備實現(xiàn)獸藥殘留的在線監(jiān)測是一個具有廣闊應(yīng)用前景的目標，值得研究和期待。