SEPT9基因在人肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

鄧沖 郭德良 謝雄偉

肝癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅國(guó)民的身體健康[1]。由于肝癌具有很強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，如何降低肝癌的侵襲和遷移，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖是臨床一致探究的問(wèn)題[2]。SEPT 9基因是GTPase活性保守基因Septin的重要成員之一[3]，參與細(xì)胞分裂、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞調(diào)控等多種生理調(diào)節(jié)[4-5]。近年來(lái)的研究顯示，SEPT 9蛋白的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，臨床已將其作為多種惡性腫瘤早期篩查的重要標(biāo)志物[6-7]，但關(guān)于SEPT 9基因如何調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移的研究尚無(wú)明確報(bào)道，因此本文通過(guò)構(gòu)建SEPT 9的靶向shRNA，沉默該基因的表達(dá)，分析其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力的影響，為今后肝癌靶向藥物的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)研究參考。

材料與方法

一、主要試劑

肝癌HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7細(xì)胞購(gòu)于ATCC，DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、青霉素和鏈霉素、胰蛋白酶、嘌呤霉素等(上海生工生物股份有限公司；中國(guó))；EDU、MTT(Sigma公司；美國(guó))，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司；中國(guó))；HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin、β-actin等一抗蛋白(Santa Cruz公司，美國(guó))；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗(Thermo公司，美國(guó))；SEPT9陰性對(duì)照病毒(SEPT9-NC)、SEPT9靶向shRNA(靶向序列為5′-GGCAGCCCATCATGAAGTTCA-3′)購(gòu)于上海吉瑪公司；細(xì)胞裂解液、ECL化學(xué)發(fā)光試劑及其他試劑、耗材(北京索萊寶科技有限公司, 中國(guó))。

二、主要設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱(SanYo公司，日本)，DNM-9606酶標(biāo)分析儀(北京朗普新技術(shù)有限公司 中國(guó))；EVOS FL 型全自動(dòng)智能成像系統(tǒng)(Thermo，美國(guó))；濕轉(zhuǎn)儀(AB公司，美國(guó))，電泳儀(Bio-red，美國(guó))，凝膠成像系統(tǒng)(DNR公司，以色列)；XD-202倒置顯微鏡(南京江南永新光學(xué)有限公司)；其他儀器購(gòu)于德國(guó)eppendorf公司。

三、細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2。隔天換液一次，細(xì)胞融合度達(dá)到85%以上時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，三次傳代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

四、SEPT9蛋白高表達(dá)細(xì)胞系篩選

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)其的細(xì)胞106個(gè)，提取腫瘤組織的總蛋白，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行蛋白定量。12% SDS-PAGE電泳分離，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，4℃條件依次加入封閉液孵育2 h，SEPT9抗體孵育過(guò)夜(稀釋比例均為1∶1 000)，二抗孵育2 h(稀釋比例均為1∶5 000)。用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)分析蛋白條帶，蛋白表達(dá)定量分析用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，內(nèi)參采用β-actin。篩選SEPT9蛋白高表達(dá)細(xì)胞系，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

五、慢病毒轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SEPT9蛋白高表達(dá)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃,5% CO2條件下，待細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋度達(dá)到50%時(shí)進(jìn)行慢病毒感染，按照試劑操作說(shuō)明書要求，進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染，對(duì)照組加入20 μL培養(yǎng)基；陰性對(duì)照組加入20 μL SEPT9陰性對(duì)照病毒(SEPT9-NC，滴度2×108TU/mL)；抑制組加入6 μL SEPT9干擾病毒(SEPT9-shRNA：滴度9×108TU/mL)以及2 μL的polybrene(5 μg/μL)，轉(zhuǎn)染過(guò)夜后(約16 h)每天更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng)5 d后向培養(yǎng)基中加入終濃度為2 μg/mL的嘌呤霉素進(jìn)行耐藥細(xì)胞株的篩選，westernblot鑒定病毒轉(zhuǎn)染效果，將轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。未經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染空病毒細(xì)胞(SEPT9-NC)為陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染抑制基因病毒(sh-SEPT9)為實(shí)驗(yàn)組。

六、細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，100 μL/孔接種于96孔板，37 ℃, 5% CO2條件下，過(guò)夜培養(yǎng)(約16 h)過(guò)夜培養(yǎng)，根據(jù)EdU染色試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)細(xì)胞增殖。完全培養(yǎng)基稀釋EdU溶液，作用濃度為10 μM，每孔加入100 μL，孵育4 h后棄培養(yǎng)基，PBS清洗兩次，多聚甲醛固定，Apollo染色，立即檢測(cè)或用抗熒光淬滅封片后，保存檢測(cè)。

七、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室中進(jìn)行。取5 μg 纖粘連蛋白用移液器均勻的涂抹在小室內(nèi)的PVPF聚碳酸濾膜外表面；同樣的操作方式在膜的內(nèi)側(cè)表面涂5 μg matrigel。調(diào)整細(xì)胞濃度，每室分別接種2×105細(xì)胞對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；37 ℃, 5% CO2溫箱培養(yǎng)4 h。PBS清洗三次并去除小室中膜內(nèi)側(cè)表面多余的細(xì)胞，多聚甲醛進(jìn)行固定；400倍顯微視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野, 倒置顯微鏡下采用雙盲計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)膜下表面的細(xì)胞數(shù)目平均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)三次。

八、劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

將劃痕實(shí)驗(yàn)插件置于24孔板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)，37 ℃, 5% CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜(約16 h)。小心移去劃痕實(shí)驗(yàn)插件，用完全培養(yǎng)基潤(rùn)洗3次，加入10 μM絲裂霉素，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基，顯微鏡下拍照，時(shí)間點(diǎn)為0時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h拍照分析細(xì)胞的遷移情況。

九、westernblot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，細(xì)胞量為5×105個(gè)于1.5 mL離心管，westernblot操作方法參見(jiàn)1.2.2，提取細(xì)胞蛋白，分析沉默SEPT9蛋白后對(duì)肝癌細(xì)胞HIF-1α、Ki67、PCNA、MMP-9、VEGF、Vimentin, N-cadherin、E-cadherin蛋白的表達(dá)影響，蛋白表達(dá)定量分析用Image J圖像分析軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析，內(nèi)參采用β-actin。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、SEPT9高表達(dá)細(xì)胞系篩選

結(jié)果如圖1所示，通過(guò)對(duì)5種肝癌細(xì)胞系HepG2、Bel-7402、MHCC97、Hep3B、Huh-7等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SEPT9蛋白在各細(xì)胞系均有表達(dá)，蛋白表達(dá)定量分析顯示，HepG2細(xì)胞中的表達(dá)量相對(duì)較高。因此本文選擇HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，研究沉默SEPT9基因表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

圖1 SEPT9蛋白在不同肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

二、慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組細(xì)胞SEPT9蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著變化(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)組HeGp2細(xì)胞SEPT9蛋白表達(dá)顯著降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)。多次傳代培養(yǎng)后westernblot檢測(cè)顯示，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染所構(gòu)建的SEPT9蛋白低表達(dá)HeGp2細(xì)胞株性質(zhì)穩(wěn)定，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。

圖2慢病毒轉(zhuǎn)然sh-SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞SEPT9表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比：***P<0.001

三、SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞增殖的影響

結(jié)果如圖3A所示，與對(duì)照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3B所示，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞Ki67和PCNA的表達(dá)明顯受到抑制，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.01)，表明SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞Ki76和PCNA蛋白表達(dá)明顯受到抑，增殖能力顯著降低。

四、SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞侵襲能力的影響

結(jié)果如圖4A所示，對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)為(108.69±15.21)個(gè)，HeGp2-SEPT9-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)(108.69±15.21)個(gè)，與對(duì)照組相比，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)意義(P>0.05)，SEPT9-shRNA轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少為(45.23±7.32)個(gè)，與對(duì)照組相比，差異統(tǒng)計(jì)差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B所示，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞Vimentin, N-cadherin 的表達(dá)明顯降低，E-cadherin的表達(dá)顯著增強(qiáng)，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)；表明sh-SEPT9能夠通過(guò)下調(diào)HeGp2細(xì)胞Vimentin、N-cadherin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)水平，降低細(xì)胞的侵襲能力。

五、SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞遷移能力的影響

結(jié)果如圖5A所示：與對(duì)照組相比：HeGp2-SEPT9-NC組細(xì)胞的遷移能力無(wú)明顯變化，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無(wú)意義(P>0.05)，HeGp2-SEPT9-shRNA組細(xì)胞的遷移明顯降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5B所示，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達(dá)量顯著降低，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P<0.05)；表明sh-SEPT9能夠通過(guò)下調(diào)HeGp2細(xì)胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達(dá)，降低細(xì)胞的遷移能力。

圖3 sh-SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比：***P<0.001

圖4 sh-SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組相比：***P<0.001

圖5 sh-SEPT9對(duì)肝癌HeGp2細(xì)胞遷移能力的影響 與對(duì)照組相比：***P<0.001

討 論

Septin基因是廣泛純?cè)诔参镆酝獾膸缀跛姓婧松铮荊TPase活性的保守基因，廣泛分布在人體的多個(gè)組織或細(xì)胞中，參與細(xì)胞分裂、胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞調(diào)控等多種生理調(diào)節(jié)。SEPT 9基因是septin基因家族中重要成員之一，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)微絲、微管及肌動(dòng)蛋白相互作用，調(diào)控蛋白運(yùn)輸。研究顯示SEPT 9蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌及血液系統(tǒng)腫瘤等組織細(xì)胞中存在明顯的高表達(dá)情況[8]，SEPT 9蛋白達(dá)沉默后正常分裂將會(huì)受到抑制，易產(chǎn)生多核細(xì)胞。因此本文通過(guò)構(gòu)建SEPT 9的靶向shRNA，研究沉默該基因的表達(dá)，對(duì)肝癌細(xì)胞增殖侵襲能力的影響。

通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞SEPT 9蛋白表達(dá)檢測(cè)顯示，HeGp2細(xì)胞表達(dá)量相對(duì)較高，本文通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染，沉默HeGp2細(xì)胞SEPT 9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示SEPT 9-shRNA轉(zhuǎn)然后，HeGp2細(xì)胞SEPT 9蛋白表達(dá)顯著降低，多次傳代后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SEPT 9-shRNA對(duì)HeGp2細(xì)胞SEPT9蛋白沉默作用能夠穩(wěn)定遺傳，表明本文構(gòu)建的HeGp2-SEPT 9-shRNA細(xì)胞系成功，能夠用于后續(xù)課題的研究。

通過(guò)EdU染色[9]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞的增殖的數(shù)量明顯減少，增殖能力顯著降低(P<0.05)。Western blot對(duì)SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞Ki67和PCNA的表達(dá)分析顯示，與對(duì)照組相比，SEPT 9-shRNA組細(xì)胞Ki67和PCNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。由于沉默細(xì)胞SEPT9蛋白表達(dá)后，能夠抑制細(xì)胞的有絲分裂，而Ki67是一種核抗原[10]，PCNA細(xì)胞有絲分裂間期DNA合成所必需的一種核蛋白[11]，均參與細(xì)胞有絲分裂，其活性與細(xì)胞增殖能力密切相關(guān)。因此沉默HeGp2細(xì)胞SEPT9蛋白表達(dá)后，細(xì)胞的增殖受到抑制，分裂能力降低，造成Ki67和PCNA蛋白的表達(dá)量顯著降低。

上皮-間葉轉(zhuǎn)化(EMT)是發(fā)生在胚胎時(shí)期的生理過(guò)程[12]，通過(guò)破壞細(xì)胞的細(xì)胞間連接，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲。這可能是肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的組織侵襲的原因，本文通過(guò)transwell小室實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞侵襲量顯著減少(P<0.05)；Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SEPT9沉默后HeGp2細(xì)胞Vimentin, N-cadherin 的表達(dá)明顯降低，E-cadherin的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.05)。由于細(xì)胞發(fā)生EMT過(guò)程中，非上皮的黏附分子如 N-cadherin、Vimentin能夠能提供微管及肌動(dòng)蛋白所沒(méi)有的彈性，改變細(xì)胞的靈活和形態(tài)，穿透上皮細(xì)胞的間隙，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的組織侵襲和遷移[13-14]。沉默SEPT9基因表達(dá)后，HeGp2細(xì)胞的Sentiment, N-cadherin的表達(dá)顯著降低，表明其EMT機(jī)制顯著受到抑制，從而降低HeGp2細(xì)胞的侵襲能力。

本文通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)也對(duì)SEPT9沉默后肝癌HeGp2細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比：SEPT9沉默后，HeGp2細(xì)胞遷移能力明顯降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，SEPT9沉默后，HeGp2細(xì)胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。這是由于HIF-1對(duì)氧氣的濃度依賴性很強(qiáng)，在低氧環(huán)境下腫瘤細(xì)胞通過(guò)刺激HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生，增強(qiáng)腫瘤組織中氧分和營(yíng)養(yǎng)的供給，同時(shí)也為轉(zhuǎn)移提供便利[15]。MPP-9作為主要的基質(zhì)金屬蛋白酶，能夠破壞腫瘤細(xì)胞遷移的組織學(xué)屏障[16]，表明沉默SEPT9蛋白表達(dá)能夠抑制細(xì)胞HIF-1α、MMP-9及VEGF的表達(dá)，降低營(yíng)養(yǎng)供給和血管新生，從而抑制HeGp2細(xì)胞的遷移。

綜上所述，SEPT9基因高表達(dá)能夠增強(qiáng)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖能力，通過(guò)EMT機(jī)制，促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。