治愈乙型肝炎的全球戰(zhàn)略

趙爽 謝青

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。國(guó)際消除HBV聯(lián)盟(ICE-HBV)是一個(gè)致力于加快開發(fā)治愈慢性乙型肝炎的專家聯(lián)盟。未來(lái)乙型肝炎治愈的研究將集中于發(fā)現(xiàn)干預(yù)策略，這種策略將永久減少具有復(fù)制能力的受感染細(xì)胞的數(shù)量或永久沉默這些細(xì)胞中共價(jià)閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸，并將刺激HBV特異性宿主免疫反應(yīng)，模擬HBV感染的自發(fā)緩解。還迫切需要建立標(biāo)準(zhǔn)化HBV試劑和方案，供全球所有HBV研究人員使用。

HBV是一個(gè)主要的全球公共衛(wèi)生威脅，全球超過(guò)2.57億人慢性感染；每年有超過(guò)88 7 000人死于HBV[1]?，F(xiàn)有的治療方法可以抑制病毒復(fù)制，但不能治愈，主要是由于病毒共價(jià)閉合的環(huán)狀脫氧核糖核酸(cccDNA)轉(zhuǎn)錄模板在受感染肝細(xì)胞中的持續(xù)存在，以及慢性感染患者未能產(chǎn)生足夠強(qiáng)的、功能性和持續(xù)的免疫反應(yīng)來(lái)清除感染。因此，在大多數(shù)情況下，治療必須終生維持。

ICE-HBV是一個(gè)國(guó)際性的、獨(dú)立的、基于研究的論壇，成立于2016年，旨在加快HBV治愈的研究。該聯(lián)盟提出了一個(gè)戰(zhàn)略性和協(xié)作性的HBV研究議程，以推動(dòng)發(fā)現(xiàn)一種安全、可支付、可推廣和有效的慢性乙型肝炎治愈方法，并在可預(yù)見的未來(lái)人人都能獲得。

一、慢性乙型肝炎與感染的緩解

急性和慢性乙型肝炎的自發(fā)緩解證明了HBV感染的免疫控制是可能的。然而，慢性感染或急性肝炎的臨床緩解并不意味著病毒的完全根除，因?yàn)樯倭康腸ccDNA陽(yáng)性肝細(xì)胞可以在這些個(gè)體中持續(xù)存在，并且可能是免疫抑制過(guò)程中病毒重新激活的來(lái)源[2]。如果要制定從受感染細(xì)胞中消除或控制其表達(dá)的策略，就迫切需要我們提高對(duì)HBV cccDNA的生物發(fā)生和同源狀態(tài)的理解。

二、HBV治愈的定義

HBV治愈需要考慮治愈HBV感染和相關(guān)肝病，由此而變得復(fù)雜(圖1)。最近美國(guó)肝病研究協(xié)會(huì)和歐洲肝病研究協(xié)會(huì)聯(lián)合舉辦的HBV治療終點(diǎn)研討會(huì)進(jìn)一步將完全治愈定義為血清中肝乙型肝炎表面抗原(HBsAg)檢測(cè)不到，以及包括肝內(nèi)cccDNA和整合HBV基因在內(nèi)的HBV基因的根除[3]。功能性治愈被定義為血清中HBsAg和HBV DNA持續(xù)不可測(cè)(伴或不伴有抗-HBsb血清轉(zhuǎn)換)以及肝內(nèi)cccDNA和HBV基因整合量持續(xù)較低水平[3]。還提出了第三個(gè)定義：部分治愈，定義為在有限療程結(jié)束后血清中可檢測(cè)到HBsAg，但HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到[3]。由于目前不可能從每一個(gè)被感染的細(xì)胞中根除HBV cccDNA微染色體庫(kù)或整合的HBV DNA，但功能性治愈仍有可能實(shí)現(xiàn)，至少目前是這樣。我們認(rèn)為慢性HBV感染的治愈性治療策略的理想目標(biāo)應(yīng)該是誘導(dǎo)與急性或慢性乙型肝炎緩解控制的那樣得以緩解，只要這種方法是安全的。

圖1乙型肝炎病毒復(fù)制周期(摘自： Revill PA, et al. Lancet Gastroenterol Hepatol,2019,4: 545-558)

由于學(xué)術(shù)界和企業(yè)界努力確定病毒靶點(diǎn)來(lái)研發(fā)藥物，許多藥物正在臨床前模型中進(jìn)行評(píng)估，或處于臨床開發(fā)的第一階段(圖2)。這些包括干擾病毒進(jìn)入的藥物、靶向cccDNA或病毒核糖核酸的藥物或其他方法、新型聚合酶或核糖核酸酶H抑制劑、核心蛋白變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和衣殼組裝調(diào)節(jié)劑、干擾HBx功能的藥物、靶向病毒和HBsAg出口的藥物或影響病毒蛋白質(zhì)組的試劑。其中一些化合物看起來(lái)很有希望顯著降低HBV病毒載量或循環(huán)HBsAg，或兩者都有顯著降低，并促進(jìn)抗-HBs的產(chǎn)生，但迄今為止似乎沒有一種化合物能夠治愈HBV感染。這些方法都不是直接針對(duì)HBV cccDNA庫(kù)，但是將這些方法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行評(píng)估，以確定它們?cè)赾ccDNA清除動(dòng)力學(xué)中的有效性或它們改善抗病毒免疫應(yīng)答恢復(fù)的能力將是很重要的。

圖2 當(dāng)前和未來(lái)治療和治愈慢性乙型肝炎所需的HBV病毒學(xué)和免疫學(xué)靶標(biāo)

乙型肝炎治愈的研究工作應(yīng)集中于減少每個(gè)細(xì)胞的cccDNA分子數(shù)量和含cccDNA的細(xì)胞數(shù)量，并誘導(dǎo)HBV特異性免疫應(yīng)答。為了實(shí)現(xiàn)HBV治愈的目標(biāo)，ICE-HBV提出了兩種策略，即在不殺死被感染細(xì)胞的情況下治愈HBV感染和誘導(dǎo)免疫控制以安全消除被感染細(xì)胞。這些方法中的每一種都需要有統(tǒng)一協(xié)調(diào)的臨床研究來(lái)支持，以推進(jìn)HBV治愈。下面詳細(xì)描述了這些策略，以及推進(jìn)HBV治愈所必需的臨床方法。

三、乙型肝炎治愈的策略

(一)在不殺死被感染細(xì)胞的情況下治愈HBV感染 自從發(fā)現(xiàn)HBsAg以來(lái)，已經(jīng)過(guò)去了50多年。2012年HBV入胞受體NTCP的發(fā)現(xiàn)徹底改變了我們體外研究從感染到出胞的HBV復(fù)制周期的能力，必須解決我們對(duì)HBV復(fù)制周期和宿主免疫反應(yīng)的理解中的重要差距，從而利用復(fù)制周期中的漏洞來(lái)治愈感染。

靶向cccDNA微染色體庫(kù)，消除cccDNA將是治愈慢性HBV感染最直接和有效的策略。目前的抗病毒藥物不能消除cccDNA。細(xì)胞因子給藥，包括α-干擾素，可以誘導(dǎo)APOBEC依賴的病毒脫氧核糖核酸脫氨作用，這一觀察引起了關(guān)于這是否會(huì)導(dǎo)致受感染肝細(xì)胞中cccDNA顯著減少的熱烈討論[4]。直接靶向cccDNA的方法 (如CRISPR/Cas9或其他基因編輯方法) 在實(shí)驗(yàn)室研究中已顯示出有希望的結(jié)果，但包括肝細(xì)胞遞送、非靶向效應(yīng),以及它們也切割染色體整合的HBV基因從而引發(fā)染色體重組的不可預(yù)測(cè)后果的可能性等問題需要仔細(xì)考慮。由于這些潛在的危險(xiǎn)和困難，必須進(jìn)一步探索針對(duì)病毒或宿主蛋白質(zhì)的方法，這些蛋白質(zhì)對(duì)cccDNA的形成、穩(wěn)定性和表達(dá)(如HBx)至關(guān)重要。對(duì)cccDNA產(chǎn)生、維持和周轉(zhuǎn)的基本生化、細(xì)胞和生理基礎(chǔ)的研究勢(shì)在必行，因?yàn)橄齝ccDNA是唯一有可能最終安全、持久地治愈HBV感染的策略。

由于在急性或慢性感染的自發(fā)或治療誘導(dǎo)的緩解控制過(guò)程中沒有完全根除cccDNA，因此在藥理學(xué)上不可能完全根除cccDNA。在大部分cccDNA被消除后，剩余的cccDNA池的轉(zhuǎn)錄沉默或者抗體介導(dǎo)的病毒從剩余的受感染細(xì)胞傳播的預(yù)防可能也是必要的。cccDNA表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制可以通過(guò)靶向HBx蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，這對(duì)于cccDNA的表達(dá)或穩(wěn)定性至關(guān)重要。因此，必須更深入地了解HBx、HBc和其他病毒蛋白在控制cccDNA同源狀態(tài)中的作用。Smc5/6復(fù)合物是宿主限制因子，在缺乏HBx蛋白的情況下抑制cccDNA的表達(dá)[5]。最近發(fā)現(xiàn)，HBx通過(guò)劫持含有細(xì)胞DDB1的E3泛素連接酶以靶向Smc5/6復(fù)合體進(jìn)行降解來(lái)促進(jìn)cccDNA轉(zhuǎn)錄[5]。因此，針對(duì)HBx-DDB1結(jié)合相互作用的治療方法也值得研究。轉(zhuǎn)錄后控制cccDNA或整合的HBV基因表達(dá)可以使用核糖核酸干擾來(lái)實(shí)現(xiàn)；目前正在努力實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，并取得了可喜的成果。還迫切需要開發(fā)原位、單細(xì)胞、單分子、活細(xì)胞分析，以可視化cccDNA的定位和運(yùn)輸，以及cccDNA依賴的替代報(bào)道細(xì)胞系統(tǒng)，用于高通量篩選cccDNA抑制劑。

(二)誘導(dǎo)免疫控制以安全消除HBV感染細(xì)胞 先天免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的復(fù)雜相互作用對(duì)病毒清除至關(guān)重要，這些應(yīng)答的失敗可能導(dǎo)致肝臟疾病。CD8+ T細(xì)胞是消除病毒的主要效應(yīng)細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞溶解和非細(xì)胞溶解效應(yīng)發(fā)揮功能。然而，保護(hù)性免疫需要足夠的CD4細(xì)胞活性和中和抗HBV包膜抗體的產(chǎn)生。研究者已做出重大努力，將急性感染HBV清除的有效綜合反應(yīng)與慢性乙型肝炎患者觀察到的免疫應(yīng)答失調(diào)進(jìn)行比較。這些知識(shí)已帶來(lái)了第一代免疫療法，第二代治療性疫苗的開發(fā)也進(jìn)入了I期和II期臨床試驗(yàn)。

1．當(dāng)前慢性HBV感染的免疫療法

在動(dòng)物模型和HBV感染患者中進(jìn)行的研究已經(jīng)確定了可以作為治療目標(biāo)的免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵點(diǎn)。注射靶向Toll樣受體或RIG-1的配體可抑制HBV小鼠模型中的病毒復(fù)制。這一觀察結(jié)果導(dǎo)致了針對(duì)TLR-7[6]、TLR-8和RIG-1[7]的藥物開發(fā)，以用于慢性HBV感染患者。大量實(shí)驗(yàn)表明，阻斷抑制受體可以增強(qiáng)HBV特異性T細(xì)胞在體外和體內(nèi)的擴(kuò)增和功能。這推動(dòng)了PD1/PDL1抗體在慢性HBV感染患者的I期研究中的應(yīng)用。此外，IL-12似乎對(duì)恢復(fù)慢性感染中的T細(xì)胞擴(kuò)增和功能至關(guān)重要。因此IL-12和誘導(dǎo)它的佐劑被納入新一代慢性HBV治療性疫苗。

2．HBV介導(dǎo)的T細(xì)胞耗竭和恢復(fù)機(jī)制

HBV持久性與CD8+ T細(xì)胞耗竭(在較小程度上)和病毒逃逸有關(guān)。持續(xù)暴露于高抗原負(fù)荷和肝細(xì)胞抗原呈遞在CD8+ T細(xì)胞耗竭中起關(guān)鍵作用。抑制性受體(主要是PD-1)的表達(dá)、氨基酸(如精氨酸和色氨酸)的耗竭和線粒體的改變導(dǎo)致了T細(xì)胞功能障礙[8]。此外，CD4+ T細(xì)胞輔助活性、免疫抑制細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞、粒細(xì)胞髓源性抑制細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的缺乏也導(dǎo)致CD8+ T細(xì)胞衰竭[9]。然而，這些不同機(jī)制對(duì)T細(xì)胞衰竭的相對(duì)貢獻(xiàn)還沒有很好的描述，應(yīng)該積極研究。此外，功能性T細(xì)胞修復(fù)是否可能，如果可能，HBV控制需要多少程度的T細(xì)胞修復(fù)，還沒有完全了解。了解這些內(nèi)容將可以完善我們恢復(fù)T細(xì)胞功能和改善免疫療法的目標(biāo)。另外，需要更好地理解抑制受體(如PD-1、CTLA-4、Tim-3)在疾病不同階段的相對(duì)貢獻(xiàn)，以確定最有可能受益于檢查點(diǎn)阻斷療法的患者群體。

3．應(yīng)重視疾病自然史中的B細(xì)胞

抗HBV抗體被用作解決HBV感染的生物標(biāo)志物，但B細(xì)胞和抗體對(duì)慢性HBV感染的自然史和解決方案的影響，或?qū)β訦BV感染血清轉(zhuǎn)換的影響尚未得到充分研究。B細(xì)胞可以產(chǎn)生免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10，但它們的耗竭也可以導(dǎo)致已解決感染的患者和慢性乙型肝炎患者的臨床再激活。因此，需要解決與B細(xì)胞生物學(xué)、抗體特異性和中和反應(yīng)相關(guān)的基本問題，以便將B細(xì)胞更有效地納入新的免疫治療方法。

4．準(zhǔn)確測(cè)量感染肝細(xì)胞的頻率

慢性HBV感染免疫療法的主要安全性問題是引發(fā)暴發(fā)性肝炎。因此，了解受感染肝細(xì)胞的實(shí)際數(shù)量、表達(dá)病毒抗原的肝細(xì)胞數(shù)量以及在個(gè)體患者中可被破壞而不會(huì)導(dǎo)致肝功能受損的肝細(xì)胞數(shù)量非常重要。在短期內(nèi)，需要更好的方法來(lái)定量活組織檢查或血清生物標(biāo)志物中的感染肝細(xì)胞和整合肝細(xì)胞。能夠在醫(yī)學(xué)成像儀器上顯示受感染肝臟的體內(nèi)診斷將是一個(gè)理想的長(zhǎng)期目標(biāo)。

5．臨床試驗(yàn)中免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化

臨床試驗(yàn)期間免疫監(jiān)測(cè)技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化是一項(xiàng)巨大但必需的任務(wù)。為了提高不同位點(diǎn)之間免疫監(jiān)測(cè)的一致性，我們建議開發(fā)集中管理和廣泛可用的HBV肽庫(kù)和四聚體。與此相結(jié)合的是ELISPOT和流式細(xì)胞術(shù)染色的有效方案。這種方法將有助于促進(jìn)持續(xù)的T細(xì)胞監(jiān)測(cè)。

6．免疫療法的未來(lái)

目前在第一階段試驗(yàn)中測(cè)試的檢查點(diǎn)抑制劑恢復(fù)HBV特異性CD8+ T細(xì)胞功能的潛力為HBV免疫療法提供了一個(gè)有希望的前景。然而，在未來(lái)的試驗(yàn)中，還需要解決一些重要的問題，如T細(xì)胞的修復(fù)程度、抗PD-1抗體的劑量、根據(jù)生物標(biāo)志物或疾病階段選擇可能有反應(yīng)的患者，以及修復(fù)后的T細(xì)胞造成組織損傷的不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。在這種情況下，同樣重要的是確定聯(lián)合治療的療效。例如，不同抗病毒治療或治療性疫苗接種的檢查點(diǎn)抑制劑，這在臨床前動(dòng)物模型中已被證明是有效的[10]。針對(duì)先天免疫的治療，用模式識(shí)別受體激動(dòng)劑將抗病毒功效與炎癥分開可以提高它們的治療指數(shù)。除了完善免疫療法，推進(jìn)抗病毒免疫工程的策略也有希望。T細(xì)胞受體和嵌合抗原受體基因療法規(guī)避了修復(fù)的需要[11]。然而，是否需要長(zhǎng)期植入針對(duì)HBV的基因工程T細(xì)胞，以保持對(duì)從逃避清除的受感染細(xì)胞中傳播的病毒的控制，還有待解決。這些都是在聯(lián)合治療的背景下，應(yīng)考慮和研究的免疫治療策略?；诨パa(bǔ)作用機(jī)制合理配合使用抗病毒和免疫治療藥物，有望確保有效的抗病毒作用，消除感染肝細(xì)胞，提高HBV感染治愈率。

四、促進(jìn)HBV感染治愈的綜合臨床研究

應(yīng)建立一個(gè)已經(jīng)獲得恢復(fù)的HBV感染患者血清樣本庫(kù)，包括HBsAg清除患者和免疫控制(抗-HBs)患者，并在緩解前提供適當(dāng)?shù)钠ヅ鋵?duì)照，供全球研究人員使用。研究者還迫切需要類似于艾滋病毒領(lǐng)域的HBV相關(guān)材料的集中儲(chǔ)存庫(kù)，使HBV研究人員能夠方便地在全球范圍內(nèi)獲取。

五、結(jié)論

現(xiàn)在是為全球受HBV影響的2.57億人開發(fā)和實(shí)施一種安全、可支付、可廣泛獲得的慢性乙型肝炎治愈方法的時(shí)候了。針對(duì)cccDNA庫(kù)并以安全和持久的方式刺激宿主免疫反應(yīng)的新研究計(jì)劃必須成為研究人員、基金會(huì)和政府的高度優(yōu)先事項(xiàng)。應(yīng)竭盡全力支持美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院最近對(duì)HBV或艾滋病毒/HBV免疫學(xué)、病毒學(xué)和治療學(xué)項(xiàng)目的R01呼吁。ICE-HBV力求通過(guò)促進(jìn)與研究人員(HBV領(lǐng)域內(nèi)外)、臨床醫(yī)生、制藥行業(yè)和一系列利益攸關(guān)方(包括受慢性乙型肝炎影響的社區(qū))的合作伙伴關(guān)系來(lái)實(shí)現(xiàn)其目標(biāo)，在全球范圍內(nèi)努力發(fā)現(xiàn)、開發(fā)、測(cè)試和實(shí)施HBV治愈戰(zhàn)略，以幫助確保WHO到2030年消除HBV作為公共健康威脅的目標(biāo)得以實(shí)現(xiàn)。