構(gòu)象可控DNA-金納米粒子復(fù)合材料的制備與表征

王 棒，曹行行

（合肥工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，安徽合肥230009）

金納米粒子具有良好的穩(wěn)定性[1]和生物相容性[2]以及特殊的納米尺寸效應(yīng)[3]，一直以來(lái)都是研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)。DNA 納米技術(shù)[4]提供了一種自下而上（bottom-up）程序化構(gòu)建納米材料的新方法。DNA 功能化金納米粒子（AuNP）不僅具有AuNP 的光學(xué)和物理化學(xué)特性，而且擁有可編程組裝能力以及生物相容等性質(zhì)。目前，DNA-AuNP 復(fù)合材料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物傳感[5]、膠體晶體組裝[6-7]、生物成像[8]等領(lǐng)域，但是大部分報(bào)道中的組裝方法比較復(fù)雜且產(chǎn)物產(chǎn)率不高，對(duì)組裝機(jī)制的探索仍然較少。為此需要努力探索更直接的組裝方法和更明確的組裝機(jī)制。

本文基于DNA 納米技術(shù)，實(shí)現(xiàn)巰基DNA（Y1-thiol）和金納米粒子的連接，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）成功提取“單價(jià)態(tài)”產(chǎn)物，然后與DNA 模塊中另外兩條單鏈退火組裝，即可介導(dǎo)金納米粒子形成特定的離散結(jié)構(gòu)。通過(guò)改變模塊翻轉(zhuǎn)角度等因素制備了正四面體、正八面體構(gòu)象可控的金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡（TEM）照片證實(shí)金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)的存在。結(jié)果表明，13 nm 的金納米粒子的四聚體產(chǎn)率可達(dá)60.02%。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和藥品

DYY-6C 型電泳儀；調(diào)溫萬(wàn)用電爐；24 DN 制膠器；場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM）。

瓊脂糖（Agarose B），氯化鈉（NaCl），氯金酸（HAuCl4），三（2-羧乙基）膦（TCEP），醋酸鎂（（CH3COO）2Mg·4H2O），尿素（Urea）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）DNA 序列及組裝模塊示意圖（圖1）

圖1 DNA 序列及組裝模塊示意圖

（2）DNA 修飾金納米粒子

先用變性凝膠對(duì)相關(guān)3-arm tile DNA 進(jìn)行純化，之后在紫外260 nm 處定量DNA 濃度。取適量的Y1-thiol鏈與TCEP 在0.5×TBE 緩沖液中混合作用30 min 左右，TCEP 與DNA 的摩爾計(jì)算比應(yīng)大于200。將DNA 溶液與一定量的金納米溶液相混合（通常DNA∶Au5NPs=1∶1，DNA∶Au13NPs=2∶1），緩沖體系是0.5×TBE。

（3）單價(jià)態(tài)DNA-AuNPs 的提取

將上一步得到的DNA-AuNPs 產(chǎn)物，在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。首先在膠中切取“一價(jià)態(tài)”條帶，接著利用電洗脫技術(shù)，提取出“單價(jià)態(tài)”產(chǎn)物，即金納米表面只連接了一條Y1-thiol 鏈。運(yùn)用逐漸加鹽老化的方法，添加1.0 M NaCl 使混合液中NaCl 濃度依次達(dá)到50 mM、100 mM、200 mM、300 mM、500 mM，間隔時(shí)間2～3 h。

（4）慢速退火組裝

根據(jù)紫外光下最大吸收波長(zhǎng)520 nm 處的吸收峰值，按照朗伯-比爾定律計(jì)算出“AuNPs-Y1-thiol”的濃度。在1×TAE/Mg2+緩沖液中，添加3-arm tile 的其余兩條鏈，按照一定的模塊濃度（4.0 turn-100 nM，4.5 turn-50 nM），進(jìn)行60℃～4℃慢速退火組裝。

（5）濃縮提取樣品

使用超濾管在2 000 rpm 的轉(zhuǎn)速下離心5～7 h 處理樣品；在瓊脂糖凝膠中將組裝產(chǎn)物與Y1-AuNPs 進(jìn)行速率對(duì)比，切取目標(biāo)產(chǎn)物條帶，進(jìn)行電洗脫操作。所有操作在4℃環(huán)境下進(jìn)行，確保產(chǎn)物穩(wěn)定不破碎。

1.3 TEM 表征

對(duì)于電洗脫得到的產(chǎn)物，取5 μL 滴在銅網(wǎng)上靜置10 min，放置在空氣中自然晾干轉(zhuǎn)移至樣品盒里；利用TEM表征金納米粒子的組裝情況。

2 結(jié)果與討論

圖2 是5 nm AuNP-DNA 復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳分離膠圖。泳道1 是裸金（沒(méi)有加入巰基鏈Y1SH），泳道2～5 分別為加入不同Y1SH 修飾得到的AuNP-DNA 復(fù)合物。根據(jù)膠圖結(jié)果可得知，分離得到了5 個(gè)不同DNA價(jià)態(tài)的AuNP-DNA 復(fù)合物，根據(jù)電泳速率由快至慢（凝膠中順序?yàn)樽韵露希┮来螢?AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3、AuNP-DNA4、AuNP-DNA5。其中，AuNP-DNA1、AuNP-DNA2、AuNP-DNA3 三種價(jià)態(tài)產(chǎn)物在圖2 中已經(jīng)利用圖形標(biāo)記出。切取AuNP-DNA1 電泳條帶，裝入透析袋中進(jìn)行電洗脫純化處理。對(duì)于AuNP-DNA1 而言，單條DNA 修飾的金納米粒子復(fù)合物不能承受較高的鹽濃度，因此，采用室溫條件下逐漸加鹽老化修飾短鏈DNA 的方法，增強(qiáng)其穩(wěn)定性。首先，根據(jù)吸收光譜測(cè)定了AuNP-DNA1 的濃度，然后加入合適比例T5-thiol 短鏈以保證金納米不會(huì)在高濃度鹽溶液中團(tuán)聚，對(duì)于AuNPs 來(lái)說(shuō)，T5-thiol 均為過(guò)量。其中對(duì)于Au5NPs 來(lái)說(shuō)，T5-thiol 的摩爾濃度為金納米粒子的100 倍；對(duì)Au13NPs 來(lái)說(shuō)，T5-thiol 的摩爾濃度為金納米粒子的300 倍。加鹽老化之后，再次根據(jù)吸收光譜定量AuNP-DNA1 的濃度。

圖2 5 nm AuNP-DNA 復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳分離膠圖

4Au5NP@TET 的瓊脂糖膠圖表征如圖3（a）所示。其中，4 Au5NP 表示為5 nm 金納米粒子四聚體，@TET 表示為四面體構(gòu)象。圖3（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 樣品，作為對(duì)照，泳道2 是4Au5NP@TE 退火組裝樣品，泳道3 是4Au5NP@TET 溶液樣品經(jīng)過(guò)超濾離心得到的濃縮樣品。通過(guò)對(duì)比泳道1 與泳道2、3 的電泳速率，發(fā)現(xiàn)泳道2、3 中樣品電泳速率明顯慢于泳道1 中樣品，因此，可以初步判斷泳道2、3 中樣品為金納米粒子寡聚組裝體。通過(guò)對(duì)比泳道2 與泳道3 中樣品電泳速率，發(fā)現(xiàn)超濾離心濃縮處理對(duì)金納米粒子組裝樣品的破壞作用很小，進(jìn)而排除了濃縮操作對(duì)組裝樣品的影響。

圖3（b）是4Au5NP@TET 目標(biāo)產(chǎn)物的TEM圖。根據(jù)TEM結(jié)果可以看出，主要的產(chǎn)物為金納米粒子四聚體。在TEM圖片上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)金納米粒子的較大聚集體。這與DNA 輔助金納米粒子“根據(jù)DNA 三分支模塊的組裝路徑”形成四面體構(gòu)象結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)思路相符。透射電鏡的表征結(jié)果充分證實(shí)了組裝思路是正確可行的。

圖3 4Au5NP@TET 產(chǎn)物的瓊脂糖膠圖表征（a）及TEM 表征（b）

采用相同的Au5NP-DNA1 樣品（即相同的DNA 中心鏈Y1SH），加入另外一組DNA 短鏈，可以得到不同構(gòu)象的金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)。加入兩條鏈（M2、S3）能夠與金納米粒子表面的DNA 鏈Y1SH 形成立方體結(jié)構(gòu)，所得金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)為正八面體構(gòu)象。組裝過(guò)程如前，瓊脂糖凝膠電泳表征結(jié)果如圖4（a）所示。該類組裝產(chǎn)物標(biāo)記為8Au5NP@Cube。其中，8Au5NP 表示為5 nm金納米粒子八聚體，@Cube 表示為正八面體構(gòu)象。圖4（a）中，泳道1 是Au5NP-DNA1 樣品，泳道2 是4Au5NP@TET 退火組裝樣品，泳道3 是8Au5NP@Cube組裝樣品。觀察泳道2 和3，利用M2、S3 短鏈組合制備得到了更大的金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)。切取泳道3 中的“目標(biāo)”條帶，然后在1×TAE/Mg2+緩沖液中進(jìn)行電洗脫操作，用移液槍依次取5 μL 樣品至銅網(wǎng)，靜置10 min，再采用透射電子顯微鏡進(jìn)行表征。圖4（b）是8Au5NP@Cube 產(chǎn)物的透射電子顯微圖。TEM結(jié)果表明，在DNA 鏈（M2、S3）輔助下，金納米粒子可以組裝得到八聚體。這一點(diǎn)也證實(shí)了實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，利用DNA 相互連接，便可得到正八面體構(gòu)象的金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)。

圖4 8Au5NP@Cube 產(chǎn)物的瓊脂糖膠圖表征（a）及TEM 表征（b）

我們進(jìn)一步構(gòu)筑了具有四面體構(gòu)象的Au13NP 寡聚組裝結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠電泳表征結(jié)果如圖5（a）所示。為方便區(qū)分，該類組裝產(chǎn)物分別標(biāo)記為4Au13NP@TET（4bp）、4Au13NP@TET（6bp），其中，4 Au13NP 表示為13 nm 金納米粒子四聚體，@TET 表示為四面體構(gòu)象，（4bp）（6bp）表示模塊粘性末端長(zhǎng)度為4、6 個(gè)堿基對(duì)。圖4（a）中，泳道1 是Au13NP-DNA1，泳道2 是4Au13NP@TET（4bp），泳道3 是4Au13NP@TET（4bp）離心濃縮樣品，泳道4 是4Au13NP@TET（6bp），泳道5 是4Au13NP@TET（6bp）離心濃縮樣品。通過(guò)對(duì)比泳道1 與2～5 中條帶電泳速率，認(rèn)為泳道2、3 中主要形成三個(gè)不同組裝產(chǎn)物條帶，根據(jù)電泳速率從快到慢，分析認(rèn)為可能為Au13NP二聚體、三聚體、四聚體。泳道4、5 中，三種組裝產(chǎn)物中的二聚體比例最高。分析認(rèn)為，由于TET（6 bp）相較TET（4 bp），其粘性末端堿基配對(duì)數(shù)目增加，使得模塊間相互作用增強(qiáng)，因此，容易導(dǎo)致形成較小的聚集結(jié)構(gòu)，即二聚體。此外，相比于4Au5NP@TET，4Au13NP@TET（4bp）組裝過(guò)程中出現(xiàn)了二聚、三聚的現(xiàn)象，分析認(rèn)為可能由于金納米粒子粒徑增大，導(dǎo)致粒子間的空間位阻增大。圖5（b～d）是三種組裝體的TEM表征結(jié)果。透射電子顯微圖表明，電泳速率從快到慢的三個(gè)條帶產(chǎn)物依次為Au13NP 二聚體、三聚體與四聚體。根據(jù)TEM表征結(jié)果對(duì)4Au13NP@TET（4bp）四聚體產(chǎn)物（圖5（d）樣品）做統(tǒng)計(jì)分析：統(tǒng)計(jì)了748 個(gè)Au13NP 組裝體，其中四聚體有450 個(gè)，產(chǎn)率達(dá)到了60.02%。

圖5 4Au13NP@TET 組裝產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析膠圖（a）及TEM 表征（b～d）

3 結(jié)論

本文基于DNA 納米技術(shù)，實(shí)現(xiàn)巰基DNA（Y1-thiol）和金納米粒子的連接，并利用瓊脂糖凝膠電泳（AGE）成功提取“單價(jià)態(tài)”產(chǎn)物，然后與DNA 模塊中另外兩條單鏈退火組裝，即可介導(dǎo)金納米粒子形成特定的離散結(jié)構(gòu)。通過(guò)改變模塊翻轉(zhuǎn)角度等因素制備了正四面體、正八面體構(gòu)象可控的金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)。透射電子顯微鏡（TEM）照片證實(shí)金納米粒子寡聚結(jié)構(gòu)的存在。結(jié)果表明，13 nm 的金納米粒子的四聚體產(chǎn)率可達(dá)60.02%。該過(guò)程簡(jiǎn)化了金納米粒子多聚體的制備方式，且只要通過(guò)“一價(jià)態(tài)”Y1-AuNPs 與不同DNA 結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)不同構(gòu)象的組裝，這是DNA 自組裝領(lǐng)域一大突破。