黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記開發(fā)及其在鯛科魚類中的跨物種擴增

吳仁協(xié)，翟 云，肖 瑤，牛素芳，張浩冉，黎 曉，陳偉勇

（廣東海洋大學水產(chǎn)學院，廣東 湛江524088）

黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus）隸屬于鱸形目、鯛科、棘鯛屬（Acanthopagrus），是廣泛分布于印度—西太平洋近海的暖水性中下層經(jīng)濟魚類［1］。在我國，黃鰭棘鯛主要分布于東南沿海，其肉質(zhì)鮮美、經(jīng)濟價值高，已成為我國海水魚類的重要養(yǎng)殖對象［2］。自上世紀90年代以來，由于過度捕撈、近海環(huán)境惡化以及近親繁殖等原因，黃鰭棘鯛自然資源嚴重衰退，其種質(zhì)資源出現(xiàn)明顯退化［3-4］。為了恢復與保護黃鰭棘鯛種質(zhì)資源，各國政府實施了一系列漁業(yè)管理措施。比如澳大利亞政府削減漁業(yè)資格撈捕證的頒布數(shù)量，以期控制黃鰭棘鯛的資源捕撈量［5］；日本政府在重要沿?？诎秾嵤S鰭棘鯛苗種增殖放流；在我國東南沿海常年大量放流黃鰭棘鯛魚苗［6］。目前，有關黃鰭棘鯛的生物學、養(yǎng)殖技術、人工育苗等方面已有廣泛的研究報道［7-8］。但是，關于黃鰭棘鯛種群遺傳多樣性和遺傳結構的研究報道較少［4］，這與缺乏大批量的高多態(tài)性分子標記有關，難以對其種質(zhì)資源現(xiàn)狀做出精確的遺傳學評估。

微衛(wèi)星序列（Microsatellites DNA）是由中間高度變異的核心序列和兩旁相對保守的側翼序列組成，廣泛存在于各類真核生物基因組中，分布均勻且高多態(tài)性、呈孟德爾共顯性遺傳特性，具有檢測快速、操作簡單等優(yōu)點，已成為生物種質(zhì)資源研究最為常用的第二代分子標記［9-10］。關于黃鰭棘鯛的微衛(wèi)星標記，已有學者采用傳統(tǒng)的富集文庫法共開發(fā)了24個二堿基重復的微衛(wèi)星標記［11-13］，并顯示出較高的多態(tài)性。然而，二堿基重復微衛(wèi)星位點在PCR擴增中容易因“滑動鏈錯配”產(chǎn)生影子帶而導致分型結果錯誤［14］。此外，傳統(tǒng)的微衛(wèi)星標記開發(fā)方法比如富集文庫法、基因組DNA文庫篩選法等，存在開發(fā)過程繁雜、成本高昂、效率較低等缺點，通常一次只能篩選幾個或十幾個可用位點［15］。因此，有必要借助高通量測序平臺來識別和篩選出大批量、多堿基重復的黃鰭棘鯛微衛(wèi)星位點，以促進其種群遺傳背景調(diào)查、種質(zhì)資源評估和分子標記輔助育種等相關研究。

SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment sequencing）是一種通過酶切、構建SLAF文庫和高通量測序來快速獲取樣品基因組DNA中SLAF標簽序列的簡化基因組測序技術［16］。SLAF-seq技術具有實驗成本低、開發(fā)周期短、獲取標記數(shù)量和類型豐富等優(yōu)點，是一種高效且經(jīng)濟的分子標記開發(fā)方法，已成功應用于多種魚類的微衛(wèi)星標記開發(fā)［17-20］。鑒于此，本研究采用SLAF-seq技術來篩選黃鰭棘鯛基因組DNA中高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，以期為該物種的種質(zhì)資源評估提供新的有效分子標記。同時，將所開發(fā)的微衛(wèi)星標記在9種鯛科魚類中進行跨物種擴增，以檢測開發(fā)標記在近緣種中的通用性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和基因組DNA提取

2014年7月，采集廣東雷州珍稀海洋生物國家級自然保護區(qū)（簡稱雷州保護區(qū)，下同）和陽西縣近岸的32尾野生黃鰭棘鯛用于本研究。經(jīng)形態(tài)學鑒定后，取魚體背部肌肉，先后在體積分數(shù)為75%、85%和95%的酒精中進行脫水處理，于-20℃冰箱保存。樣品基因組DNA提取采用蛋白酶-苯酚氯仿法［21］。

1.2 SLAF-seq測序和微衛(wèi)星引物合成

由北京百邁客生物科技有限公司進行1個樣品肌肉樣的高通量測序，采用SLAF-seq技術來篩選黃鰭棘鯛全基因組范圍內(nèi)的微衛(wèi)星位點?；蚪M酶切、文庫構建和高通量測序參見張浩冉等（2018）［18］的研究。采用微衛(wèi)星識別軟件MISA（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html/）對所得的微衛(wèi)星位點進行搜集與統(tǒng)計，并挑選151個二至六堿基的微衛(wèi)星位點進行引物合成。

1.3 微衛(wèi)星引物篩選、三引物PCR擴增和分型檢測

本研究的151個微衛(wèi)星位點引物多態(tài)性篩選方法參照張浩冉等的研究［18］。初步篩選出可產(chǎn)生2條及以上特異性等位基因條帶的位點即為多態(tài)性位點。根據(jù)Schuelke（2000）報道的M13標記法［22］，對篩選出的64個黃鰭棘鯛多態(tài)性微衛(wèi)星位點的正向引物5′端添加M13序列，并合成標記為FAM或HEX熒光基團的M13通用引物，引物修飾和合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。通過梯度PCR（52～62℃）重新摸索三引物（修飾的正、反向引物和M13通用引物）PCR擴增的最適退火溫度（表1）。三引物PCR反應體系和擴增產(chǎn)物檢測參照翟云等（2018）的研究［17］，由武漢天一輝遠生物科技有限公司進行PCR擴增產(chǎn)物的等位基因分型檢測。

1.4 跨物種擴增

采用9種鯛科魚類進行黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記的跨物種擴增檢測，包括太平洋棘鯛（Acanthopagrus pacificus，4尾，湛江硇洲島近岸）、黑棘鯛（Acanthopagrus schlegelii，6尾，湛江硇洲島和雷州保護區(qū)近岸）、澳洲棘鯛（Acanthopagrus australis，2尾，湛江硇洲島近岸）、臺灣棘鯛（Acanthopagrus taiwanensis，1尾，臺灣島西岸）、平鯛（Rhabdosargus sarba，6尾，湛江硇洲島和雷州保護區(qū)近岸）、二長棘梨齒鯛（Evynnis cardinalis，7尾，湛江硇洲島和雷州保護區(qū)近岸）、真赤鯛（Pagrus major，6尾，湛江硇洲島近岸）、藍點赤鯛（Pagrus caeruleostictus，2尾，北海近岸）和黃牙鯛（Dentex hypselosomus，5尾，湛江硇洲島近岸）。PCR擴增體系和擴增產(chǎn)物檢測同“1.3”。擴增結果出現(xiàn)1條或1條以上的特異性等位基因條帶的微衛(wèi)星標記即為具有通用性位點。

1.5 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)（Na）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）等基本遺傳參數(shù)由Cervus 3.0.7軟件計算［23］，各位點的哈迪-溫伯格平衡（HWE）及連鎖不平衡由GenePop 4.3軟件檢測［24］。通過Micro-Checker 2.2.3軟件在Brookfeld-1算法下估算位點的無效等位基因頻率（Fua）［25］，使用FSTAT 2.9.3軟件分析位點的近交系數(shù)（Fis）。

2 結果與討論

2.1 SLAF-seq測序

采用SLAF-seq技術，通過簡化基因組深度水平測序，共產(chǎn)生2.32 M reads讀長，其中測序質(zhì)量值（Q）大于等于30的讀長占總數(shù)的75.63%，表明大部分堿基測序出錯的概率低于0.10%。將酶切片段長度在415～514 bp的序列定義為SLAF標簽，平均測序深度為9.13×。過濾質(zhì)量較差的測序數(shù)據(jù)后，共獲得137 358個SLAF標簽。

利用MISA共搜索出30 676個微衛(wèi)星位點，其中最多的為單堿基重復，有14 018個（占總位點的45.70%，下同）；其次是二堿基重復，有12 302個（40.10%）；三堿基重復和四堿基重復也有相當數(shù)量，分別有2 833個（9.24%）和1 265個（4.12%）；五堿基重復和六堿基重復數(shù)量則較少，分別僅有222個（0.72%）和36個（0.12%）。

2.2 多態(tài)性微衛(wèi)星標記篩選和遺傳多樣性參數(shù)

經(jīng)PCR擴增檢測后，在151個二至六堿基重復微衛(wèi)星位點中有64個顯示出多態(tài)性，其多態(tài)比率為42.38%。這些多態(tài)性引物經(jīng)熒光標記修飾后，最終有47對引物在32個黃鰭棘鯛基因組DNA中擴增出具有特異性且清晰的等位基因條帶（表1），包括17個二堿基、6個三堿基、8個四堿基、10個五堿基和6個六堿基重復位點，引物序列的GenBank登錄號為MG214909～MG214955。

47個微衛(wèi)星位點擴增片段大小為102～374 bp，共檢測出464個等位基因，等位基因數(shù)在2（AL6-9）和27（AL2-9）之間（均值為10）。Ho在0.156（AL6-9）和0.938（AL4-11）之間（均值為0.628），He在0.177（AL3-7）和0.963（AL2-9）之間（均值為0.741）。47個位點的PIC平均值為0.705，有44個位點的PIC值均大于0.250，僅3個位點（AL3-7、AL3-11、AL6-9）的PIC值小于0.250，表明大多數(shù)位點顯示出較高的多態(tài)性。經(jīng)Bonferroni校正后（校正p＜0.001 1），有4個位點（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏離HWE并顯示較高的Fis值（分別為0.415、0.455、0.509、0.293）和Fua值（分別為0.163、0.212、0.221、0.128）；其余43個位點均符合HWE檢驗，且各位點之間不存在連鎖不平衡。

2.3 微衛(wèi)星標記跨物種擴增檢測

有31個黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記可在1種或1種以上鯛科魚類中有效擴增出特異性條帶（表2）。其中AL2-1、AL2-8、AL3-1、AL4-1分別可在9、8、7、6種鯛科魚類中擴增，AL2-4、AL2-9、AL2-17、AL6-7等4個位點可在4個物種中擴增，AL2-2、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL3-7、AL3-9、AL4-5、AL4-11、AL4-12、AL5-3、AL6-3、AL6-6等12個位點可在3個物種中擴增，AL2-5、AL3-11、AL4-2、AL4-4、AL6-2等5個位點可在2個物種中擴增，AL2-13、AL2-19、AL4-8、AL5-6、AL5-8、AL6-1等6個位點只在1個物種中擴增。

從表2可以看出，31個黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記在太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中的擴增成功率較高，分別為63.8%（26個位點）、51.1%（24個位點）和48.9%（23個位點）；在平鯛、二長棘梨齒鯛、真赤鯛、藍點赤鯛和黃牙鯛的擴增成功率相對較低，在前兩者中分別為14.9%（7個位點）和10.6%（5個位點），在后三者中均為8.5%（均為4個位點）；意外的是在臺灣棘鯛中的擴增成功率最低，僅為2.1%（1個位點）。在標記通用性方面，有17個黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記（AL2-1、AL2-8、AL2-9、AL2-11、AL2-12、AL2-14、AL2-17、AL3-1、AL3-7、AL3-9、AL4-1、AL4-5、AL4-11、AL5-3、AL6-3、AL6-6、AL6-7）在太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中均可擴增，而只有3個標記（AL2-1、AL2-8、AL3-1）可在二長棘梨齒鯛、真赤鯛、藍點赤鯛及黃牙鯛中擴增。

表1 黃鰭棘鯛47個多態(tài)性微衛(wèi)星標記信息及其遺傳參數(shù)Tab.1 Information and genetic indices of 47 polymorphic microsatellite markers of Acanthopagrus latus

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 黃鰭棘鯛31個微衛(wèi)星標記在9種鯛科近緣種中的跨物種擴增Tab.2 Cross-species amplifications of the 31 microsatellite markers of Acanthopagrus latus in 9 relative species of family Sparidae

續(xù)表2

2.4 討論

2.4.1 SLAF-seq技術開發(fā)微衛(wèi)星標記的優(yōu)勢 Xia等 （2006）、夏軍紅等（2007）、Ahmad-Syazni等（2012）采用磁珠富集法構建黃鰭棘鯛基因組微衛(wèi)星富集文庫分別獲得了58、41、33個二堿基重復的微衛(wèi)星序列，而后分別只開發(fā)出11、3、10個多態(tài)性微衛(wèi)星標記［11-13］。本研究基于SLAF-seq技術識別出黃鰭棘鯛16 658個二至六堿基重復微衛(wèi)星位點，在挑選的151個位點中成功開發(fā)出47個多態(tài)性微衛(wèi)星標記，其位點識別數(shù)量和開發(fā)效率比以往的研究報道提高了上百倍。此外，本研究的微衛(wèi)星位點還包含了采用傳統(tǒng)開發(fā)方法難以獲取的大量多堿基重復位點（四至六堿基重復有1 523個），有效保障了標記開發(fā)的數(shù)量要求和標記類型的多樣化?？梢?，基于SLAF-seq技術開發(fā)物種微衛(wèi)星標記具有明顯的優(yōu)勢和便利，非常適用于大規(guī)模的分子標記開發(fā)［18-19］。同時，本研究開發(fā)的30個高多態(tài)性三至六堿基重復微衛(wèi)星標記完全不同于已報道的24個黃鰭棘鯛二堿基重復微衛(wèi)星標記［11-13］，尤其是24個多堿基重復（四至六堿基）的微衛(wèi)星標記在等位基因分型中通常比二堿基重復位點具有更高的準確性和有效性［9］，可為黃鰭棘鯛種質(zhì)資源評估提供新的分子標記和分析角度。

2.4.2 黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記的多態(tài)性和HWE偏離 本研究的微衛(wèi)星位點的Na均值（10）、Ho均值（0.682）和He均值（0.742）均低于Xia等［11］和Ahmad-Syazni等［13］所報道的黃鰭棘鯛二堿基重復微衛(wèi)星位點的Na均值（分別為17.1、18.1，下同）、Ho均值（0.74、0.867）和He均值（0.91、0.92）。這可能與本研究含有較多的四至六堿基重復位點（占總位點的51.06%），而之前所開發(fā)的二堿基重復位點通常比多堿基重復位點具有更高的遺傳變異有關［26］。然而，本研究的Ho均值不但高于Dewoody等（2000）統(tǒng)計的32種魚類微衛(wèi)星標記的Ho均值（0.63）［27］，也稍高于花鱸（Lateolabrax maculatus）、帶魚（Trichiurus japonicus）和沙帶魚（Lepturacanthus savala）微衛(wèi)星標記的Ho均值（分別為0.674、0.620、0.634）［10，18-19］，表明所開發(fā)的47個黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記具有較高的多態(tài)性和遺傳變異水平。PIC可反映遺傳標記的多態(tài)性程度，當PIC≥0.500時，該位點為高度多態(tài)位點；當0.250≤PIC＜0.500時，為中度多態(tài)位點；當PIC＜0.250時，則為低度多態(tài)位點［28］。本研究的47個微衛(wèi)星標記PIC平均值為0.705，有41個位點呈高度多態(tài)性，且各位點間不存在連鎖不平衡。表明所開發(fā)的大部分微衛(wèi)星標記含有豐富的遺傳變異信息，在黃鰭棘鯛種群遺傳資源研究中具有較高的潛在應用價值。

經(jīng)過Bonferroni校正后，本研究有4個位點（AL2-16、AL4-12、AL5-1、AL5-9）偏離HWE，顯示出雜合子缺失現(xiàn)象。同時這4個位點均具有較高的Fis（0.293～0.415）和Fua（0.128～0.221），提示近親交配和無效等位基因可能是造成這4個位點偏離HWE的重要原因。此外，隨著人工繁殖技術不斷成熟和完善，中國沿海黃鰭棘鯛的養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，增加了養(yǎng)殖群體的逃逸機會，同時近年來各沿海先后開展了大規(guī)模的增殖放流活動，這些人為因素加劇了黃鰭棘鯛種群的生態(tài)遺傳風險，可能導致養(yǎng)殖群體與野生群體的種質(zhì)混雜和降低種群遺傳多樣性［7］。因此，種群退化和自然選擇導致本研究4個微衛(wèi)星位點偏離HWE的可能性還難以排除［29］，有待于今后進一步研究確認。

2.4.3 黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記在鯛科魚類中的通用性 本研究的黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記在同屬的太平洋棘鯛、黑棘鯛和澳洲棘鯛中的跨物種擴增成功率較高（48.9%～63.8%），其次是在平鯛中（14.9%），而在二長棘梨齒鯛、真赤鯛、藍點赤鯛及黃牙鯛中的成功率較低（8.5%～10.6%），表明跨物種擴增成功率與物種間遺傳距離有直接的相關性［30］?；诰€粒體COI基因序列的系統(tǒng)進化關系研究表明中國鯛科魚類可分為兩大類群，類群I包括四長棘鯛屬（Argyrops）、犁齒鯛屬（Evynnis）、赤鯛屬（Pagrus）、牙鯛屬（Dentex）等紅體色種類，類群Ⅱ含平鯛屬（Rhabdosargus）、棘鯛屬等銀灰體色種類［31］。可見，除了棘鯛屬外，黃鰭棘鯛與平鯛屬的親緣關系更近于它與其他鯛科魚類。這種系統(tǒng)進化關系與本研究的跨物種擴增結果相對應。同時，本研究的跨物種擴增結果也從核基因方面進一步支持了中國鯛科魚類屬間的系統(tǒng)劃分［31］。值得注意的是，黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記在臺灣棘鯛中的跨物種擴增成功率（2.1%）遠低于棘鯛屬和其他鯛科魚類，僅有1個位點具有通用性。這可能與臺灣棘鯛可檢測樣品數(shù)量少（僅1尾）且基因組DNA質(zhì)量不佳有關，難以擴增出清晰的微衛(wèi)星條帶，導致實驗結果出現(xiàn)誤差。

除臺灣棘鯛外，本研究的跨物種擴增成功率（平均值為26.85%）低于帶魚和沙帶魚的微衛(wèi)星標記在6種帶魚科魚類中的跨物種擴增成功率（平均值分別為33.86%和41.43%）［18-19］，但大于花鱸在10種尖吻鱸科和鮨科魚類中的跨物種擴增成功率（3.8%～15.4%）［10］，這可能與研究所檢測的種類數(shù)量有關，也可能與不同科的屬、種間的遺傳分化程度有關。此外，本研究有17個標記在棘鯛屬（除臺灣棘鯛）中能有效擴增，說明這些標記具有較好的通用性，可以適用于該屬魚類的系統(tǒng)進化和種群遺傳學分析。但只有3個標記可在二長棘梨齒鯛、真赤鯛、藍點赤鯛及黃牙鯛中有效擴增，難以滿足后續(xù)種質(zhì)資源評估對分子標記數(shù)量的要求。

3 結論

基于SLAF-seq技術，本研究在識別出大量微衛(wèi)星位點的基礎上，成功開發(fā)出47個二至六堿基重復的多態(tài)性黃鰭棘鯛微衛(wèi)星標記，為該物種的種質(zhì)資源評估和種群遺傳分析提供了新的有效分子標記。本研究的開發(fā)方法為其他魚類的微衛(wèi)星標記篩選提供了可靠的方法參考和經(jīng)驗借鑒。同時，17個開發(fā)標記在棘鯛屬中具有較好的通用性，可為該屬魚類的分子系統(tǒng)進化研究提供新的標記來源和研究角度。