非熱殺菌技術殺滅食品中芽孢效能及機理研究進展

白 妍，葛雨珺，向迎春，李 苑，丁 甜，胡亞芹,*

（1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，馥莉食品研究院，浙江省食品加工技術與裝備工程實驗室，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310058；2.重慶工貿(mào)職業(yè)技術學院，重慶 408000）

作為人類賴以生存和發(fā)展的重要物質前提，食品的質量安全直接影響國民身體健康及生命安全。微生物導致的腐敗變質是威脅食品質量安全、造成食品工業(yè)中巨大經(jīng)濟損失的主要因素之一，因此，殺菌成為食品加工過程中的必要工序。食品工業(yè)中應用的殺菌方法主要包括熱殺菌和非熱殺菌，其中熱殺菌（如巴氏殺菌、高溫瞬時殺菌等）因滅菌效果好、操作方便等優(yōu)點而得到廣泛應用。然而，由于高溫可能會對食品品質產(chǎn)生影響，導致食品顏色變化、產(chǎn)生異味、營養(yǎng)損失等不良后果，同時高溫殺菌具有污染環(huán)境、能源消耗量大等劣勢，因此非熱殺菌技術日益成為新型殺菌技術研究和開發(fā)的重點[1]。

非熱殺菌技術是食品工業(yè)新型加工技術，具有殺菌條件易控、受外界條件影響較小等優(yōu)點；非熱殺菌處理過程中，食品物料可以保持相對較低的溫度，對食品的色、香、味以及營養(yǎng)成分影響較小，同時有利于保持食品中各種功能成分的生理活性，可以滿足消費者對高品質食品的要求[1]。目前食品工業(yè)中滅活芽孢的非熱殺菌技術主要有如高靜壓（high hydrostatic pressure，HHP）技術、高壓CO2（high-pressure CO2，HPCD）技術、低溫等離子體（non-thermal plasma，NTP）技術、紫外輻射（ultraviolet light，UV）技術、脈沖電場（pulsed electric field，PEF）技術等，本文綜述這些非熱殺菌技術獨立處理或與其他處理技術相結合對芽孢滅活的效果及其機理，分析各種非熱殺菌技術的研究進展和應用前景，著重討論其在食品行業(yè)中的應用以及芽孢滅活的分子機制，以期為生產(chǎn)安全食品、降低不同種類食品中微生物污染提供解決方案。

1 芽孢與食品安全

芽孢是由產(chǎn)芽孢桿菌在營養(yǎng)條件缺乏時產(chǎn)生的休眠體，廣泛存在于環(huán)境中，是食品工業(yè)中的主要微生物污染源之一，易引起食品安全事故。19世紀后半葉，芽孢作為細菌休眠體被研究者發(fā)現(xiàn)，并因其高抗性逐漸受到重視，已有大量研究致力于探究芽孢抵抗外界極端環(huán)境的分子機制。盡管芽孢在休眠狀態(tài)下代謝并不明顯，但其仍能持續(xù)監(jiān)測周圍環(huán)境的營養(yǎng)狀況，并在適宜的環(huán)境條件下萌發(fā)和恢復生長[2]。此外，芽孢對濕熱和干熱、紫外線輻射和γ射線輻射、極端干燥（包括真空）和氧化劑等不利條件均具有高抗性，因此在加工處理中芽孢極有可能存在于最終產(chǎn)品中，并在一定條件下萌發(fā)生長，最終導致食品腐敗，甚至引起食源性疾病[3]，芽孢的滅活效果可用來評價食品的殺菌程度[4]。

溫度低于100 ℃的熱殺菌處理可以殺滅致病菌以及其他有害微生物，但不足以殺滅抗逆性極強的細菌芽孢[5]。芽孢的高度抗逆性主要是由于其獨特的多層結構（孢外壁、芽孢衣、外膜、皮層、內(nèi)膜、芽孢核等）所致[6]，這些結構可以起到保持芽孢內(nèi)部水分含量、限制有害物質進入等作用，常規(guī)的食品工業(yè)殺菌工藝很難將其危害性消除。對芽孢進行滅活的應用和分子機制研究一直以來都是食品工業(yè)所面臨的嚴峻挑戰(zhàn)和重要課題。

2 HHP技術

2.1 HHP殺菌技術研究與應用現(xiàn)狀

HHP技術是目前食品商業(yè)殺菌中應用最廣泛的新型非熱殺菌技術[7]，主要是在冷藏或室溫（4～25 ℃）下，利用高壓（400～600 MPa）對食品進行處理以延長其貨架期，保持食品新鮮，其殺菌效果與巴氏殺菌相當，與傳統(tǒng)熱殺菌相比可以較好地保持食品的品質[8]。近年來HHP技術在食品殺菌中的應用逐漸成熟，國內(nèi)外關于HHP滅活芽孢的研究報道逐漸增多（表1），無論是在純培養(yǎng)條件還是在食品介質中，HHP技術都具有優(yōu)良的芽孢滅活效果。

表1 HHP技術滅活芽孢效果Table 1 Efficacy of HHP in inactivation of spores

目前，HHP技術在滅活芽孢中的應用仍處于基礎研究階段，少見對商品化的產(chǎn)品進行芽孢殺滅，HHP滅活芽孢受到pH值、溫度等多種外部因素的影響：在低pH值條件下進行HHP處理時，芽孢的熱抗性更低[14]；H H P處理溫度影響芽孢的萌發(fā)狀況，Black等[15]發(fā)現(xiàn)，誘導芽孢釋放吡啶二羧酸（dipicolinic acid，DPA）并萌發(fā)的最佳溫度隨壓力的變化而發(fā)生改變；Robertson等[16]研究了兩種加壓流體的HHP處理對芽孢桿菌屬芽孢的滅活效果，結果表明使用硅油作為加壓流體的HHP處理具有更好的滅活效果。由此可見，HHP技術在實際應用中需要根據(jù)產(chǎn)品的實際情況確定生產(chǎn)參數(shù)以優(yōu)化芽孢滅活效果。

此外，對HHP滅活芽孢動力學的研究也取得了一定進展。Olivier等[17]首次將F值（在一定殺菌壓力和溫度下，殺死一定濃度的某種微生物所需時間）用于全面定量地確定HHP滅活芽孢的效果；Uchida等[18]利用Weibull模型對600 MPa處理條件下不同糖度的麥芽提取物肉湯中A. acidoterrestris芽孢滅活過程進行擬合，并確定一級動力學參數(shù)；Doona等[19]通過HHP設計了芽孢萌發(fā)動力學的“準化學”模型，將萌發(fā)和滅活的微分方程模型整合到一個由HHP建立的芽孢動力學綜合模型中。

2.2 HHP滅活芽孢機制

HHP滅活芽孢的機制可以歸結為3 個階段，其中包括高壓誘導芽孢萌發(fā)階段、芽孢多層結構的破壞階段以及芽孢的最終滅活階段[9]。HHP處理過程中高壓及其變化直接導致芽孢內(nèi)部結構的變化，使其產(chǎn)生一定的機械損傷，同時改變芽孢膜蛋白的理化性質以及芽孢內(nèi)部的水分含量，引起其內(nèi)部DPA釋放、酸溶性小蛋白（small acid-soluble proteins，SASPs）降解、萌發(fā)受體（germinant receptors， GRs）激活等一系列生理變化，進而引起芽孢亞致死損傷、萌發(fā)和失活[20]。

近年來，對HHP誘導芽孢萌發(fā)的研究取得了很大進展，尤其是HHP誘導芽孢萌發(fā)的分子機制[6]，隨著HHP處理壓力的變化，誘導芽孢萌發(fā)的機制也會發(fā)生變化。低壓（100～150 MPa）可以誘導芽孢萌發(fā)。Black等[21]的研究表明，150 MPa、37 ℃處理7 min可使約90%芽孢萌發(fā)，這種萌發(fā)是通過誘導GRs實現(xiàn)的。一旦GRs被低壓處理激活，芽孢內(nèi)核釋放Ca-DPA從而激活芽孢內(nèi)主要的皮質溶解酶（cortex lytic enzymes，CLEs）。低壓條件下，由于萌發(fā)蛋白酶的激活，芽孢中的SASPs會發(fā)生降解，從而導致芽孢比更高壓力（500 MPa）單獨處理下更易滅活，這也說明SASP在芽孢熱抗性中的重要作用[22]。中高壓（500～600 MPa）也可以誘導芽孢萌發(fā)，其機制與低壓誘導芽孢萌發(fā)不同[23]。中高壓主要通過作用于芽孢內(nèi)膜上的DPA通道誘導DPA以及其他小分子物質釋放，從而激活芽孢內(nèi)的CLEs。這種機制在枯草芽孢桿菌（B. subtilis）芽孢和蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）芽孢中都得到了證明，表明中高壓處理可以誘導部分具有皮層水解機制芽孢的萌發(fā)[24]。此外，孫靜等[25]的研究表明，無論低壓還是中高壓HHP處理都可以促進芽孢核中Ca-DPA的釋放和皮層的降解，從而降低芽孢的熱抗性，而在350 MPa和550 MPa的中高壓處理下，B. subtilis芽孢熱抗性降低的原因是高壓誘導芽孢產(chǎn)生的亞致死損傷，而不是芽孢萌發(fā)。

因此，HHP可以調節(jié)芽孢的萌發(fā)機制，降低其對后續(xù)滅活處理的抗性。然而，高壓誘導的芽孢萌發(fā)只發(fā)生于芽孢桿菌屬，對于梭菌屬則沒有這種效應[24]。由于部分芽孢對目前工業(yè)上應用的HHP處理（例如650 MPa、50 ℃）具有抗性以及芽孢自身獨特的生理特性，因此可以改進HHP工藝或配合其他殺菌條件來滅活芽孢，如間歇HHP工藝可以先誘導芽孢萌發(fā)，瀉壓后施加更高的壓力滅活芽孢；HHP與熱處理、超聲波、PEF、UV、輻照、細菌素、化學試劑等滅菌技術相結合可以降低HHP所需壓力、縮短處理時間并降低處理成本。這種基于現(xiàn)代柵欄技術、以HHP為主的復合殺菌方法將成為非熱殺菌領域最具潛力和經(jīng)濟效益的一項技術[20]。

3 HPCD技術

3.1 HPCD殺菌技術研究與應用現(xiàn)狀

HPCD是一種通過CO2的分子效應及其他未知機理而起到滅活微生物作用的一種新型殺菌技術，一般來說，HPCD主要利用50 MPa以下處于特殊形態(tài)的CO2，包括超臨界態(tài)和亞臨界態(tài)CO2，其中應用較多的是超臨界CO2[26]。自1951年Fraser等[27]首次將HPCD作為殺菌技術滅活大腸桿菌菌體細胞，在過去的60多年中，HPCD的殺菌效能及其機理逐漸成為非熱殺菌領域的研究重點。與傳統(tǒng)殺菌方式相比，HPCD殺菌技術具有一定優(yōu)勢：CO2不易燃且無毒，這意味著HPCD處理是環(huán)境友好的，且無有毒物質殘留；用于滅菌的CO2壓力（通常低于30 MPa）遠低于HHP（100～600 MPa）處理，這使得HPCD技術中使用的壓力更易于控制；此外，與熱處理相比，HPCD處理時溫度更低，因此對食品的營養(yǎng)成分和理化性質的影響較小[5]。李鳳娟[28]采用響應面分析實驗對HPCD滅活B. subtilis芽孢效能進行了研究，在壓力25.6～28.8 MPa、溫度40～47 ℃、保壓時間36.5～47.0 min的條件下，芽孢失活率可達到3.48 個數(shù)量級，這表明HPCD對芽孢具有良好的殺滅效果，其中壓力、溫度、保壓時間都是重要的影響因素。

雖然HPCD可以有效殺滅致病菌、腐敗菌、酵母以及霉菌的營養(yǎng)細胞（低于30 MPa、20～40 ℃），HPCD在較溫和的溫度（20～40 ℃）下難以使結構更加復雜的細菌芽孢失活[5]。因此，為了增強HPCD技術對芽孢的滅活效果，大量研究將HPCD與熱處理、循環(huán)加壓、化合物處理等技術結合，利用HPCD復合殺菌技術提高滅活細菌芽孢的效能。高媛等[29]的研究表明45 ℃預熱處理可以提高HPCD（20 MPa）芽孢失活率1.4 個數(shù)量級；Karajanagi等[30]提高HPCD處理（7～9 MPa）B.subtilis芽孢的溫度（60～70 ℃），殺滅芽孢數(shù)量可達7（lg（CFU/mL））；Spilimbergo等[31]使用循環(huán)加壓的方法處理B.subtilis芽孢，在較低溫度（36～50 ℃），殺滅芽孢數(shù)量可達0.8～2.0（lg（CFU/mL））；Spilimbergo等[32]將HPCD與PEF技術相結合（20 MPa、40 ℃、900 min）處理B.cereus芽孢，殺滅芽孢數(shù)量約為1.5（lg（CFU/mL））。此外，有研究表明，HPCD處理與乙醇、乙酸、檸檬酸、H2O2、PAA等化合物協(xié)同處理也可提高芽孢的滅活效果[5]。

3.2 HPCD滅活芽孢機制

目前對于HPCD滅活芽孢的機理主要有兩種主流的假設：一部分學者通過HPCD滅活芽孢的動力學研究，提出“萌發(fā)滅活機制”，即芽孢在HPCD處理過程中首先被活化和萌發(fā)，然后被滅活[33]；此外，有學者通過HPCD處理后芽孢失活的形態(tài)學和分子學分析，提出了“結構破壞和失活機制”，這是另一種可能的HPCD處理芽孢使其失活的假設機制，即芽孢結構被破壞，導致芽孢死亡[34]。Rao Lei等[35]對B.subtilis芽孢進行HPCD處理，對芽孢的萌發(fā)、內(nèi)膜和皮層的滲透性、DPA的釋放情況以及芽孢形態(tài)和內(nèi)部結構的變化進行了研究，結果表明HPCD處理不會使芽孢萌發(fā)也不會降低其熱抗性，但會增加芽孢內(nèi)膜和皮層的滲透性，破壞芽孢的結構。此外，根據(jù)B.subtilis芽孢在HPCD處理下的滅活動力學，可以將滅活過程分為兩個階段：第一階段滅活率較低，而第二階段芽孢顯著失活。第一階段中，CO2滲透進入芽孢外部結構中，可能導致一部分重要化學物質的釋放從而促進芽孢在結構不被破壞的狀態(tài)下失活[36]；也有研究提出HPCD滅活芽孢與一些酶的失活有關，由于CO2的水合產(chǎn)物導致芽孢內(nèi)部pH值的降低從而抑制芽孢內(nèi)部的正常代謝[37]。這些機制可能在處理過程中同時發(fā)生，并最終導致芽孢的失活。

雖然已有研究提出了幾種HPCD處理滅活芽孢的機制，但由于缺乏豐富和明確的數(shù)據(jù)，HPCD滅活芽孢的機理很難得到完全闡明，需要進行更深入和更全面的分析來探明HPCD處理滅活細菌芽孢的機理[38]。雖然近期的研究表明“結構破壞和失活機制”更具說服力，但目前HPCD是如何準確地作用于芽孢并破壞孢子的內(nèi)膜的機制仍不清楚，需要進一步的實驗來研究內(nèi)膜特性的變化，并鑒定其損傷導致HPCD處理芽孢失活的特定蛋白質。此外，還需要加強HPCD滅菌的數(shù)學模型的建立，以闡明滅菌機理并確定最佳工藝條件[5]。

4 NTP技術

4.1 NTP殺菌技術研究與應用現(xiàn)狀

等離子體被稱為除固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)以外的第4種物質存在狀態(tài)，廣泛存在于宇宙之中，由完全或部分離子化、整體呈現(xiàn)電中性的多種活性粒子（原子、電子、放電粒子、UV光子等）組成。當對氣體施加的能量超過其本身分子間作用力時，氣體分子會被激發(fā)產(chǎn)生自由電子，這些自由電子會與周圍的分子或者原子發(fā)生碰撞，從而產(chǎn)生能量更高的激發(fā)態(tài)原子、離子以及自由電子[39]，各種粒子的混合體即為等離子體。在NTP中，電子的溫度遠低于其他粒子的溫度，從而保持一種熱力學不平衡狀態(tài)，因此NTP的整體溫度可以保持在相對較低的溫度（低于60 ℃）[40]。與傳統(tǒng)熱殺菌技術相比，NTP技術處理溫度較低、殺菌速度快，具有一定的優(yōu)勢，同時應用于食品殺菌時，具有無有害成分殘留的優(yōu)點[41]。

NTP技術可以有效殺滅食品介質中的芽孢，不同類型等離子體激發(fā)裝置對芽孢均可以產(chǎn)生滅活效果，Kim等[42]使用微波NTP處理洋蔥粉中的B.cereus芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量可達1.1～2.1（lg（CFU/mL））；Los等[43]用空氣介質阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）等離子體處理谷粒中的萎縮芽孢桿菌（B.atrophaeus）芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量約為5（lg（CFU/mL））；Hertwig等[44]使用射頻等離子體射流處理黑胡椒中的B.subtilis和B.atrophaeus芽孢，其殺滅芽孢數(shù)量為2.4～2.8（lg（CFU/mL））。

NTP對芽孢滅活效果受很多因素的影響，如工作氣體組成、輸入功率、處理時間等處理參數(shù)，這些參數(shù)會改變等離子體的電子密度、帶電粒子和自由基的濃度以及UV光子的數(shù)量等理化性質；此外，基質組成和尺寸、水分活度、有機物等外部環(huán)境條件以及芽孢自身的性質也是影響等離子體對芽孢滅活效果的重要因素[45]。

NTP滅活芽孢的影響因素總結如表2所示。

表2 NTP滅活芽孢的影響因素Table 2 Factors affecting the inactivation of spores by NTP

4.2 NTP滅活芽孢機制

迄今為止，NTP滅活芽孢細胞的確切機制仍不清楚，等離子體誘導的芽孢損傷是否會致其萌發(fā)尚無定論。近年來，研究集中于從等離子體對芽孢的外部結構以及內(nèi)部成分等不同靶點來探究NTP滅活芽孢的機理。

Raguse等[52]研究表明，等離子體作用于B. subtilis芽孢外膜、內(nèi)膜、芽孢衣等結構進而導致芽孢滅活，通過原子力顯微鏡可以觀察到經(jīng)過等離子體處理后的芽孢表面粗糙度增加并產(chǎn)生裂紋，這可能是由于活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等自由基的作用以及離子轟擊與積累對這些芽孢結構中的化學鍵產(chǎn)生破壞[53]。而對于等離子體產(chǎn)生的UV光子，其主要作用靶點是位于芽孢核內(nèi)的DNA，DNA受UV輻射會產(chǎn)生對芽孢具有潛在致命危害的光產(chǎn)物胸腺嘧啶聚合物[54]。Roth等[55]發(fā)現(xiàn)，缺乏核苷酸切除修復和α/β型DNA結合SASPs的B. subtilis芽孢對NTP具有更高的敏感性，而缺乏芽孢光產(chǎn)物裂解酶DNA修復途徑芽孢的敏感性較低，因此可見，NTP是通過芽孢光產(chǎn)物形成以外的機制導致DNA損傷。此外，NTP對芽孢中的關鍵代謝蛋白（Ger A、Ger B和Ger K）、離子和DPA通道（SpoV）、其他萌發(fā)相關酶（如CLEs、CwlJ、SleB）[54,56]產(chǎn)生影響進而導致芽孢失活。因此，等離子體滅活芽孢可分為兩個階段：在第一階段，NTP的UV光子、自由基或離子迅速滅活位于頂部的大多數(shù)芽孢；隨著等離子體粒子滲透得更深，到達滅活的第二階段，即芽孢外部結構、DNA和蛋白質逐漸受到活性物質（如RNS、ROS和離子）的蝕刻作用，導致芽孢滅活[45]。

NTP對細菌芽孢具有優(yōu)越的滅活效果，在食品殺菌中具有廣闊前景，然而其誘導芽孢滅活的機制尚沒有得到完全闡述，NTP的殺菌效果與等離子體種類、參數(shù)設置以及環(huán)境因素等密切相關，這也增加了實際應用和優(yōu)化加工條件的難度[57]。

5 UV技術

5.1 UV殺菌技術研究與應用現(xiàn)狀

紫外光的波長位于100～400 nm范圍內(nèi)，包括UV-A（315～400 nm）、UV-B（280～315 nm）、UV-C（200～280 nm）、VUV（100～200 nm）。其中在食品工業(yè)中主要利用波長在200～280 nm范圍內(nèi)的UV-C進行殺菌，UV輻射廣泛用于液體介質食品的殺菌以及延長固體食品如新鮮產(chǎn)品、肉制品和蛋制品的貨架期[58]。一般稱UV及其鄰近可見光譜范圍與其他能量較低的輻射為非電離輻射，而X射線、γ射線以及電離粒子（β射線、α射線、質子）等則為電離輻射，非電離輻射的吸收可以導致原子和分子產(chǎn)生激發(fā)電子[59]。

UV輻射對菌體細胞的殺菌機理主要是其可以產(chǎn)生大量能量使營養(yǎng)細胞DNA中的嘧啶堿基形成二聚體，從而干擾DNA轉錄和翻譯過程[60]。然而，芽孢比營養(yǎng)細胞的UV抗性更強，有研究表明殺滅90%炭疽桿菌芽孢所需的UV強度為810 J/m2，而殺滅90%同一菌株營養(yǎng)細胞所需的UV強度為60 J/m2[61]；可見芽孢對UV輻射具有抗性，該抗性是由于部分芽孢可以在UV輻射損傷后進行修復[62]，這種修復可能是由于光解酶可以與UV形成的二聚體結合，并利用從可見光中獲得的能量來逆轉二聚體的形成[63]。為了克服芽孢對UV的抗性和光解酶修復的現(xiàn)象，有研究利用準分子UV激光照射來增強芽孢滅活效率[64]。此外，將UV處理與熱、H2O2等處理結合可以提高UV輻射對芽孢滅活的效果[65]。

UV輻射作為非熱殺菌技術，在液體食品的殺菌和固體食品貨架期的延長等方面具有重要應用。然而，由于芽孢對UV輻射具有較強抗性以及光修復能力，選擇合適的UV輻射劑量和協(xié)同處理方法是應用中需要重點關注的問題。此外，由于UV可通過各種有機光反應在食品中產(chǎn)生自由基從而對食品品質產(chǎn)生不良影響，如蛋白質變性、脂質氧化、顏色變化、異味、營養(yǎng)物質損失等[59]，在UV輻射應用中應選擇適宜的食品進行處理以減少其品質的降低。

5.2 UV滅活芽孢機制

UV主要通過對芽孢的外部結構進行破壞進而滅活芽孢。Esbelin[66]研究了芽孢衣缺陷菌株、α、β型SASPs缺陷菌株與野生菌株的芽孢在320～1 770 mJ/cm2脈沖UV和25～150 mJ/cm2連續(xù)UV-C處理下的滅活情況，結果表明芽孢衣缺陷型菌株對脈沖UV的敏感性顯著高于野生型菌株，α和β型SASPs缺陷菌株芽孢對兩種處理的敏感性均高于野生型菌株，表明芽孢的外部結構在保護芽孢抵抗UV中具有重要作用，而α、β型SASPs是芽孢進行光修復的重要成分。此外，Warriner等[67]研究發(fā)現(xiàn)UV（27.10 J/mL）和溫和熱處理（60 ℃、3.58 min）協(xié)同作用可以將殺滅B. coagulan芽孢的數(shù)量提高2（lg（CFU/mL）），這表明UV處理可能導致芽孢的熱敏性增強從而提高芽孢滅活效果。

6 PEF技術

6.1 PEF殺菌技術研究與應用現(xiàn)狀

PEF技術主要利用短周期脈沖電流滅活食品中的微生物[68]，PEF殺菌常用電路強度一般為15～100 kV/cm、脈沖1～100 kHz、放電頻率1～20Hz[1]?，F(xiàn)有研究結果表明，PEF具有許多優(yōu)于巴氏殺菌的特點，但是PEF的應用仍然僅限于液體產(chǎn)品中[69]，其對于半固體或固體產(chǎn)品滅菌的適用性尚未確定。PEF對食品品質的影響較小，可以在保持食品營養(yǎng)價值的同時滅活微生物營養(yǎng)細胞，但其滅活細菌芽孢的應用相對較少[70]。為了有效滅活細菌芽孢，有研究將PEF與熱處理或抗菌化學提取物結合。據(jù)報道，PEF在195 kJ/kg下與133 ℃熱處理結合，B.subtilis芽孢殺滅芽孢數(shù)量可達4（lg（CFU/mL）），模型分析結果表明熱處理和PEF處理的殺滅芽孢數(shù)量分別為1.15（lg（CFU/mL））和3.2（lg（CFU/mL））[70]。此外，有研究表明抗菌化學提取物（如精油和多酚）與PEF協(xié)同作用對于芽孢桿菌屬芽孢有較好的滅活效果，如各種精油具有的活性成分可以作為萌發(fā)物與受體結合的屏障，抑制芽孢萌發(fā)，對B.subtilis芽孢抑制活性最高的是豆蔻精油，其殺滅芽孢數(shù)量約為3.12（lg（CFU/mL））[71]。

6.2 PEF滅活芽孢機制

國內(nèi)外學者對PEF的研究相對比較成熟，對其殺菌機理提出了電崩解理論、電穿孔理論、臭氧效應、黏彈極性形成模型等假說，其中電崩解理論和電穿孔理論更為廣大學者所接受[69]。電崩解理論是指外加電場強度可以增大細胞膜上的跨膜電位差，并且電位差隨著電場的增強不斷增大，細胞膜厚度減小，當電位差達到臨界崩解電位差時細胞膜就會發(fā)生破裂穿孔[72]；而電穿孔理論是指PEF作用于微生物細胞膜會改變其脂肪和蛋白質分子的結構，使微生物細胞膜收縮形成小孔，隨著電場強度的增強，細胞膜形成大量小孔，細胞膜通透性增大，胞內(nèi)物質泄漏進而導致微生物失活[73]。

PEF滅活芽孢的機理主要與芽孢多層結構在PEF處理下發(fā)生的變形有關（表3）。Barsotti等[74]研究表明，在電場強度為15 kV/cm、脈沖時間為5 s的脈沖作用下，鹽溶液中的B.atrophaeus芽孢表面形成多相分布的孔隙，由短周期脈沖引起的損傷可以在短期內(nèi)被封存，在此期間芽孢可以保持抗性并使PEF的滅活效率低下[75]；但是，如果脈沖持續(xù)時間較長，則其造成的損害是不可逆轉的[76]。此外，PEF處理效果受芽孢種類等因素的影響[77]，當PEF處理B.atrophaeus時，芽孢具有明顯的孔隙，然而當PEF處理芽孢桿菌屬其他芽孢時，芽孢數(shù)量并未顯著降低，這表明芽孢的萌發(fā)狀態(tài)及其種類會影響PEF的殺菌效果[78]。

表3 非熱殺菌技術滅活芽孢效果與機理Table 3 Mechanisms of action of non-thermal sterilization technologies in the inactivation of spores

7 其他非熱殺菌技術

電離輻射、超聲、臭氧處理等方法也是常用的非熱殺菌技術。朱軍等[79]研究發(fā)現(xiàn)利用60Co γ射線可以殺滅核桃粉中的微生物，當控制適宜的輻射殺菌劑量（8～9 kGy）時，輻射在不影響核桃粉品質的同時對核桃粉中的菌落總數(shù)、耐熱芽孢和耐熱桿菌芽孢等都具有很好的殺滅效果；超聲處理常常作為其他殺菌技術的輔助處理方法，例如超聲輔助加熱[80]、超高壓協(xié)同聲熱[81]、超聲協(xié)同表面活性劑[82]等，這些協(xié)同殺菌技術可提高獨立超聲處理的殺菌效果；臭氧溶液可以對B.subtilis芽孢產(chǎn)生一定損傷，其機理可能是臭氧可破壞芽孢的內(nèi)膜[83]。此外，使用化學試劑（環(huán)氧乙烷、二氧化氯等）也是具有良好滅活芽孢效果的方法之一，但在使用時應考慮其在具體加工環(huán)境的使用劑量及其對食品的影響[84]。

8 結 語

細菌芽孢的滅活是當前食品工業(yè)面臨的重大挑戰(zhàn)，近年來出現(xiàn)了大量滅活芽孢的非熱殺菌技術，這些技術在相對溫和的條件下進行，避免了高溫對食品品質的不良影響，其中研究相對成熟的主要有HHP技術、HPCD技術、NTP技術、UV技術以及PEF技術。

HHP不僅可以導致芽孢內(nèi)部結構及其理化性質的改變，還可以誘導芽孢萌芽降低其抗性以獲得更好的滅活效果，但HHP對設備的要求較高，在實際生產(chǎn)應用中具有一定局限性。HPCD滅活芽孢的機制尚有爭議，目前認為HPCD主要破壞芽孢結構進而導致滅活，單獨處理對芽孢的滅活效果不佳時可與其他殺菌方式相結合以優(yōu)化HPCD滅活效果。NTP技術具有溫度低、速度快、能耗低、無殘留等優(yōu)點，自由基、離子以及UV光子等各種活性成分的積累和滲透可對芽孢外部結構和DNA、蛋白質等內(nèi)部成分產(chǎn)生破壞，然而目前NTP技術主要作用于物料表面，處理不規(guī)則食品時需要提高其殺菌均勻性。UV技術在食品的殺菌和貨架期延長等具有重要應用，但應用UV技術需考慮其對食品品質的不良影響。

此外，由于部分非熱殺菌技術滅活芽孢的程度有限，滅活機理尚未得到完全闡明，且獲得的結果變化很大，嚴重阻礙其在食品工業(yè)中的應用；因此非熱殺菌技術對芽孢滅活的影響因素及其機理是未來研究的重要內(nèi)容。此外，從現(xiàn)有殺菌技術的協(xié)同滅活芽孢的效果來看，誘導萌發(fā)和滅活技術相結合是保持食品新鮮品質和保護食品免受芽孢桿菌侵染的有效途徑，柵欄技術是具有前景的芽孢滅活方法。