不同連作年限烤煙根際土壤真菌群落18S rDNA-PCR-DGGE分析

許自成，王發(fā)展，金伊楠，王蒙蒙，熊亞南，郝浩浩，許曉敬

（1．河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；2．河南省煙草公司駐馬店市公司，河南 駐馬店 463000）

烤煙為忌連作作物，但我國烤煙連作現(xiàn)象普遍存在，導(dǎo)致煙株生長發(fā)育不良，抗病抗逆能力降低，煙葉產(chǎn)質(zhì)量下降，嚴重影響煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展［1-4］。土壤微生物對環(huán)境改變和脅迫的反應(yīng)非常敏感［5］，并在土壤內(nèi)部的變化過程中扮演著重要的角色，因此根際微生物活動是研究烤煙連作障礙的又一重要突破口。近些年來，越來越多的學(xué)者認為根際微生態(tài)失調(diào)可能是連作障礙發(fā)生的主要原因并進行大量研究。古戰(zhàn)朝等［6］研究發(fā)現(xiàn)，根際土壤中細菌的數(shù)量隨連作年限的增加大致呈“升－降－升－降”的趨勢，并跟隨烤煙連作年數(shù)的延長，根際土壤中細菌所占比例顯著降低，真菌比例顯著增加，放線菌比例變化則無明顯規(guī)律。符建國等［7］認為連作造成土壤的理化性質(zhì)惡化并使植物根系分泌化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生自毒作用，這影響了土壤微生物群落的多樣性。羅文富等［8］通過對云南煙區(qū)煙草疫霉的研究，認為連作煙田病菌密度高于輪作煙田，可能是隨著連作年限的增加，細菌的數(shù)量減少，真菌的數(shù)量增加。但是，目前有關(guān)連作植煙土壤微生物多樣性的研究大多集中在連作對土壤微生物數(shù)量和細菌群落結(jié)構(gòu)的影響方面［9-12］，針對不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響的研究較為有限。而且，多數(shù)研究主要采用傳統(tǒng)微生物平板培養(yǎng)法，利用分子生物學(xué)手段較少［13］。平板培養(yǎng)法能較為直觀地統(tǒng)計微生物的數(shù)量，但只能反映極少數(shù)微生物的信息［14］。因此，本研究以河南漯河煙區(qū)為例，采用變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)并結(jié)合真菌的18S rDNA基因測序研究不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，以期揭示連作植煙土壤微生物群落多樣性與結(jié)構(gòu)變化特征，為進一步完善烤煙連作障礙理論提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況及樣品采集

試驗于2014年在河南省漯河市郾城區(qū)烤煙生產(chǎn)基地（東經(jīng)114°00′，北緯33°58′）進行。供試烤煙品種為豫煙10號，由漯河市煙草公司提供。該地區(qū)植煙土壤為淋溶性黃褐土，土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量為有機質(zhì)8.12～11.31 g/kg，pH值 7.62～7.83，堿解氮72.6～80.3mg/kg，有效磷15.4～26.1 mg/kg，速效鉀113.2～169.5mg/kg。年均氣溫為14.7℃，年均日照時數(shù)2181h，全年無霜期為216～225d，年均降水量為786mm。

試驗設(shè)3個處理，分別為烤煙輪作（前茬為玉米）、烤煙連作3年和烤煙連作6年。采用大區(qū)對比設(shè)計進行比較，每個處理面積為2 000 m2，種煙行距、株距分別為110、60 cm。各處理采用“S”型采集法，分別在烤煙團棵、旺長、成熟3個時期，在近株距10cm處，采集0～20cm土壤，重復(fù)多次混勻，剔除碎石子及植物殘體等，用無菌袋保存于-80℃帶回實驗室，用于DGGE的測定分析。土壤編號分別為Ⅰ-V1（輪作團棵期）、Ⅰ-V2（連作3年團棵期）、Ⅰ-V3（連作6年團棵期）、Ⅱ-V1（輪作旺長期）、Ⅱ-V2（連作3年旺長期）、Ⅱ-V3（連作6年旺長期）、Ⅲ-V1（輪作成熟期）、Ⅲ-V2（連作3年成熟期）和Ⅲ-V3（連作6年成熟期）。

1.2 真菌DGGE的分析測試

1.2.1 真菌基因組DNA的提取及PCR擴增

本實驗土壤總DNA提取采用美國MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的FastDNATMSPIN Kit For Soil，提取方法按試劑盒使用說明進行操作。以樣品總DNA為模板，采用北京博友順生物技術(shù)有限公司提供的特異性引物GC-Fung（CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CAT TCC CCG TTA CCC GTT G）/NS1（GTA GTC ATA TGC TFG TCT C）進行擴增［15］。PCR 采用 50μL 反應(yīng)體系:10× PCR buffer 5μL；dNTP（2.5 mmol/L）3.2μL；rTaq（5U/μL）0.4μL；真菌用 GC-Fung（20 mmol/L）1μL；NS1（20mmol/L）1μL，模板DNA 100 ng；補ddH2O至50μL。PCR擴增程序為:真菌為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、55℃復(fù)性30s、72℃延伸30s、30個循環(huán)；最終72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit純化回收，PCR儀為Biometra公司生產(chǎn)的T-gradient，凝膠成像儀為Bio-Rad公司的Gel-Doc2000凝膠成像系統(tǒng)。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析

取10μLPCR的產(chǎn)物進行變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析［16］，真菌采用變性梯度為25%～40%、濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠在1×TAE緩沖液［17］中150V 60℃下電泳8h。變性梯度凝膠電泳（DGGE）完畢后，采用銀染法［18］染色。

1.2.3 DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序

用滅菌的手術(shù)刀切下待回收DGGE條帶，采用OMEGA公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的條帶，以2μL回收產(chǎn)物為模板，以不帶GC夾子的引物進行PCR擴增［19］。

將重新擴增的DNA片段切膠回收、純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，菌液由華大基因?qū)Σ迦氲恼婢?8S rDNA片段進行序列測定。

1.2.4 序列分析

將測序所得的真菌18S rDNA優(yōu)勢菌的序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫，在GenBank中使用Blast程序進行同源性比較，獲得最相似典型菌株的18S rDNA序列。

1.3 統(tǒng)計分析方法

DGGE條帶采用Quantity One軟件分析；Redundancy analysis（RDA）采用CANOCO 5.0軟件進行；圖表繪制及數(shù)據(jù)的整理在Excel 2007軟件上進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌DGGE圖譜分析

所得18S rDNA片段通過變性梯度凝膠電泳技術(shù)能分離長度相同而堿基組成不同的DNA序列（圖1），可以看到明顯分離的條帶有24條，且多數(shù)條帶為每個泳道所共有，說明這些處理土壤中大多數(shù)真菌類型是共有的。條帶位置和數(shù)目存在一定差異，說明存在特有的真菌類型。此外，這些公共條帶的亮度也有差異，說明土壤真菌在DNA水平上有明顯的改變并且真菌種群間的協(xié)同演替機制受連作影響。運用Quantity One軟件對圖譜進行基本的背景排除，經(jīng)過泳道、條帶識別以及配對等步驟得到電泳虛擬圖（圖2），可以更加直觀的看出每個樣品的條帶差異情況。從條帶數(shù)量上看，各處理土壤均表現(xiàn)為成熟期＞旺長期＞團棵期，可見烤煙生育中后期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成比較復(fù)雜。此外，隨著生育期的推移，連作的真菌群落變化較輪作明顯，且連作6年的變化程度大于連作3年，由此可知不同連作年限對烤煙根際土壤真菌群落有較大影響。

圖1 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌DNA圖譜

圖2 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌DNA電泳虛擬圖

2.2 真菌群落相似性指數(shù)分析與聚類分析

運用Quantity One 軟件對 DGGE 圖譜做相似性分析，得到不同處理真菌群落相似性指數(shù)（表1）。結(jié)果顯示，整體上各樣品間相似性指數(shù)均處于較低水平，表明輪作與連作土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)有較大差異，且隨著連作年限的延長，相似性是降低的，這說明連作對土壤真菌群落的功能多樣性有影響，且隨著連作年限的增加影響越大，這與真菌DGGE圖譜分析的結(jié)果一致。

表1 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌群落相似性指數(shù)

基于各樣本DGGE條帶的位置、數(shù)量和亮度，采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行UPGMA聚類分析，見圖3。所有樣品真菌群落按相似程度可以分為5類，輪作土壤旺長期、連作6年和連作3年的成熟期的真菌群落（Ⅱ-V1、Ⅲ-V3、Ⅲ-V2）能較好聚成一類，連作3年團棵期、連作6年團棵期以及連作3年的旺長期的真菌群落（Ⅰ-V2、Ⅰ-V3、Ⅱ-V2）聚為一類，輪作的團棵期（Ⅰ-V1）、連作6年的旺長期（Ⅱ-V3）、輪作的成熟期（Ⅲ-V1）真菌群落各自為一類，這同樣說明連作較大程度地改變了土壤真菌的遺傳多樣性，且不同時期對真菌群落有較大影響。

圖3 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌群落聚類分析

2.3 真菌群落多樣性比較

表2所示，真菌多樣性指數(shù)在幾個樣品之間都有所差別。從豐度（S）來看，整體上成熟期＞旺長期＞團棵期，連作6年＞輪作＞連作3年。對于均勻度（E），在團棵期，連作6年＞連作3年＞輪作；在旺長期，輪作＞連作3年＞連作6年；在成熟期，連作6年＞輪作＞連作3年，其中最大值出現(xiàn)在連作6年的團棵期，各土壤樣品E值有一定差別，也說明了連作改變了真菌群落結(jié)構(gòu)。從香濃指數(shù)（H）和辛普森指數(shù)來看，整體上各土壤樣品在旺長期和成熟期真菌多樣性較高，同時期連作6年土壤樣品真菌多樣性均大于輪作與連作3年土壤，與豐度結(jié)果一致。

表2 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期真菌多樣性指標

2.4 DGGE條帶回收序列分析

真菌條帶測序后經(jīng)NCBI比對得到表3。結(jié)果表明，從9個樣品的DGGE圖譜中成功回收的24個條帶與數(shù)據(jù)庫中的模式菌株都具有一定的同源性，且相似度在92%～100%，多數(shù)與已知菌種的相似度高達97%～100%。一般認為序列同源性小于98%，屬于不同種的真菌，同源性小于93%～95%，則屬于不同的屬［20-21］。因此可以認為真菌菌群優(yōu)勢菌為角擔菌科（Ceratobasidiaceae）的立枯菌絲核菌（Rhizoctonia solani）和煙草靶斑?。═hanatephorus cucumeris）、盤菌科（Rhizoctonia）、被孢霉科（Mortierellaceae）、鐮刀菌屬（Fusarium）、生赤殼科（Bionectriaceae）、漆斑菌屬（Myrothecium）、傘菌科（Agaricaceae）、鏈格孢屬（Alternaria）、球蓋菇科（Strophariaceae）、炭角菌目（Xylariomycetidae）、鏈壺菌科（Lagenidiaceae）、腐霉科（Pythiaceae）、花冠菌屬（Corollospora）、梳霉科（Kickxellaceae）等。

表3 優(yōu)勢真菌群落的測序克隆序列與其GenBank最相似序列的比對結(jié)果

此外，條帶9、12、13、16、18存在于烤煙不同生育時期各連作處理土壤中，但條帶亮度有不同程度差異，說明其所代表的是烤煙連作土壤中土著的真菌優(yōu)勢種群。而條帶11、20和23的真菌種群是連作3年和連作6年土壤中出現(xiàn)過的，條帶1的真菌種群僅出現(xiàn)在連作3年的土壤樣品中，條帶3、4和15的真菌種群僅出現(xiàn)在連作6年的土壤樣品中，說明不同連作年限造成一些特異菌群的變化，特別是連作3年和連作6年與輪作相比造成了某些特異性真菌的出現(xiàn)。除此之外，不同生育期植煙土壤真菌結(jié)構(gòu)也有一定差異。條帶2只出現(xiàn)于烤煙團棵期的輪作土壤，且亮度清晰可辨，其與立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）相似度為99%，可能同屬真菌；盤菌科主要分布在連作6年的土壤中，而盤菌科存在于多腐生與腐殖質(zhì)豐富的土壤中，少數(shù)寄生子囊能夠引起植物的根腐、莖腐、葉斑等，這也說明了隨著連作年限的延長，土壤中病原物質(zhì)增多。條帶7主要存在輪作和連作3年團棵期煙田，與尖孢鐮刀菌序列的相似性為100%，說明它在輪作各生育期和連作3年團棵期表現(xiàn)出優(yōu)勢種群；條

帶8主要存在于烤煙成熟期輪作、連作土壤中，而其與煙草靶斑?。═hanatephorus cucumeris）之間存在99%的相似度，可能是由于成熟期陰雨天氣較多，田間相對濕度較大，有利于靶斑病的發(fā)生與蔓延［22］。以上分析可見，烤煙連作后土壤的真菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

2.5 物種環(huán)境因子圖

不同連作年限植煙土壤的酶活性和養(yǎng)分含量如表4所示。將不同連作年限植煙土壤的酶活性和養(yǎng)分含量中的土壤蔗糖酶（Invertase）、脲酶（Urease）、堿性磷酸酶（AKP）、蛋白酶（Protease）活性以及土壤堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）含量與真菌條帶的相關(guān)性做RDA物種因子圖（圖4），可以看出，縱軸和橫軸所能解釋的相關(guān)變量分別為23.2%和28.1%，分析得知條帶1、2、5、8、10、11、15、19均與速效鉀含量、蛋白酶活性有較強的正相關(guān)關(guān)系，而與土壤堿解氮含量、堿性磷酸酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性有較強的負相關(guān)關(guān)系，條帶6、18、24則與之相反，并且條帶3、14、17、21、22均與有效磷含量有較強的正相關(guān)關(guān)系。這說明條帶5、8、9、15、17、18、19的菌群活動，對土壤的營養(yǎng)代謝影響較大。根據(jù)前述分析可知，條帶8、9、15主要存在于連作3年和連作6年的烤煙土壤中，說明烤煙連作后土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的變化對土壤的營養(yǎng)代謝有強烈的影響，可能是導(dǎo)致連作后烤煙生長發(fā)育受抑的重要原因。

表4 不同連作年限植煙土壤的酶活性和養(yǎng)分含量

圖4 不同連作年限植煙土壤在烤煙大田期優(yōu)勢真菌物種環(huán)境因子圖

3 結(jié)論與討論

不同連作年限烤煙根際土壤樣品在經(jīng)過 DGGE后，分離出數(shù)目不等和遷移率存在明顯差異的電泳條帶（圖1），揭示了不同連作年限烤煙各生育期根際土壤真菌群落的差異性。由電泳圖以及多樣性指數(shù)均能得出，無論是輪作還是連作烤煙生育中后期植煙土壤真菌群落最為豐富，可能是由于成熟期在8～9月份，高溫高濕條件下真菌的繁殖與活動增強，并且煙株脫落的煙葉、腳葉落入土壤，為真菌提供充足的營養(yǎng)環(huán)境，旺長期則是煙株生長發(fā)育最強時期，大量根系分泌物的產(chǎn)生也影響了真菌的繁殖生長［23］。齊虹凌等［24］通過研究輪作與連作對烤煙不同生育期根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響，認為生育期是影響烤煙根際細菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因素，而連作與輪作是次要因素。然而就本試驗而言，真菌群落變化對生育期和種植模式的響應(yīng)程度是否與細菌群落一致尚需進一步地研究。

已有相關(guān)研究認為作物連作對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了深刻影響［25-26］。本研究的DGGE分析結(jié)果表明，不同連作年限烤煙根際土壤樣品條帶數(shù)有明顯改變，連作使土壤中真菌種群的個體數(shù)明顯增多，一些優(yōu)勢種群在不同連作年限的土壤中所處的優(yōu)勢地位發(fā)生了很大變化，而且連作6年的變化程度大于連作3年，說明隨著連作年限的增加影響越大，這與何川等［9］的研究結(jié)果一致。此外，對回收條帶序列測序結(jié)果表明，不同連作年限造成一些特異菌群的變化，如盤菌科僅出現(xiàn)在連作6年的土壤中，能夠引起植物的根腐、莖腐、葉斑等，表明隨著連作年限的延長，土壤中病原物質(zhì)增多。這可能與連作土壤根系分泌物增多、土壤養(yǎng)分失衡等因素有關(guān)［27-28］。關(guān)于馬鈴薯連作的研究［19］則表明連作較輪作并未造成馬鈴薯根際土壤真菌種群數(shù)量和多樣性的顯著變化，這可能與試驗區(qū)生態(tài)環(huán)境條件及土壤類型有關(guān)，直接表現(xiàn)在作物根際的土著微生物的種類，不同種屬或功能型的微生物對連作的敏感性和受性也截然不同；另外還可能與供試作物品種有關(guān)，因為其根系分泌物種類和數(shù)量均能對根際微生物的活性和組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。有研究表明，連作土壤中某些優(yōu)勢種群富集絕大部分為鐮刀菌屬等土傳病害真菌，主要通過分泌毒素與細胞壁降解酶導(dǎo)致宿主植物發(fā)病，并且隨著連作年限的增加而逐漸成為優(yōu)勢真菌生理群［29-30］，這與本研究結(jié)果并不完全一致。從試驗結(jié)果來看，尖孢鐮刀菌屬主要存在輪作和連作3年團棵期煙田，而在連作6年土壤中未顯示。這可能是隨著煙田持續(xù)連作，土壤真菌豐富度和多樣性不斷下降，但連作持續(xù)一段時間后土壤微生態(tài)系統(tǒng)出現(xiàn)恢復(fù)或趨于達到一個新的相對穩(wěn)定狀態(tài)，其它真菌群落限制了尖孢鐮刀菌屬的生存［31］。值得注意的是，土壤漆斑菌屬存在于烤煙生長的整個大田期，有研究表明漆斑菌屬廣泛存在于植物和土壤中，而且大都具有很強的纖維素分解能力，部分菌類還能夠產(chǎn)生抗生素［32］，土壤漆斑菌屬的存在可能對連作土壤微生態(tài)的自我修復(fù)或化學(xué)營養(yǎng)環(huán)境的改善有重要影響。總的看來，這些微生物在植煙土壤真菌優(yōu)勢種群平衡中的作用鮮有報道。

微生物群落在土壤有機質(zhì)分解和營養(yǎng)元素循環(huán)中有著至關(guān)重要的作用［33］。楊宇虹等［34］指出煙草連作對土壤營養(yǎng)元素循環(huán)相關(guān)微生物數(shù)量有重要影響。土壤微生物群落功能指標與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切，且相互影響。長期連作使土壤的理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)惡化，導(dǎo)致土壤微生物的多樣性和活性下降，從而降低煙草的產(chǎn)質(zhì)量和加重?zé)煵萏镩g病害［9］。本研究中RDA物種因子圖結(jié)果顯示長期連作導(dǎo)致土壤真菌菌群結(jié)構(gòu)變化，并且煙草靶斑病原與土壤蛋白酶活性有強烈的正相關(guān)關(guān)系，腐霉科則與土壤速效鉀有強烈的正相關(guān)性，鏈壺菌科、生赤殼科的菌群活動與土壤的堿解氮含量、蔗糖酶活性、脲酶活性、堿性磷酸酶活性都有強烈的正相關(guān)性，反映了真菌群落與土壤營養(yǎng)元素的關(guān)系，但是它們在原位生態(tài)環(huán)境中的生理生化特性及其所具備的生態(tài)功能意義有待進一步的研究。本研究采用的DGGE作為一種分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠直觀地比較和分析微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，定性地比較土壤微生物群落的差異，尤其是優(yōu)勢微生物類群，但其無法檢測基因組中DNA含量少于1.5%的種群，導(dǎo)致不能反映樣品中部分低豐度菌種，而高通量測序能提供更多關(guān)于低豐度細菌類群的信息［35-36］，因此在后續(xù)研究中可采用DGGE技術(shù)與高通量測序相結(jié)合的方法進行，以便能更全面系統(tǒng)地分析不同連作年限土壤樣品中真菌群落差異，從而為完善連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)提供更加全面、真實的信息。