抗人類免疫缺陷病毒1型廣譜中和抗體的研究進(jìn)展

張子凌，劉明斌，徐建青，張曉燕

復(fù)旦大學(xué)附屬公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計(jì)，目前全世界大約有 3 700 萬(wàn)人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染者?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒療法能夠顯著延長(zhǎng)感染者的壽命。然而，從發(fā)現(xiàn)HIV至今，艾滋病仍無法治愈。20世紀(jì)末，在一些處于慢性感染期的HIV感染者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種能中和多種不同類型HIV病毒株的抗體，稱為廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibody，bNAb)[1]。這些體內(nèi)產(chǎn)生了廣譜中和抗體的感染者表現(xiàn)出更強(qiáng)控制病毒載量的能力[2]。因此，人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生HIV廣譜中和抗體的保護(hù)機(jī)制及其誘導(dǎo)策略值得深入探索。

1 HIV廣譜中和抗體的保護(hù)機(jī)制

HIV主要感染CD4+T細(xì)胞與單核-巨噬細(xì)胞，還能將自身基因組通過反轉(zhuǎn)錄整合到宿主基因組。潛伏感染的病毒及基因高度變異的病毒可逃脫宿主免疫，在病毒長(zhǎng)期慢性感染過程中，部分患者體內(nèi)變異的病毒抗原持續(xù)刺激宿主而逐漸產(chǎn)生廣譜中和抗體，這些個(gè)體中病毒滴度可得到良好控制，從而顯著延長(zhǎng)感染者的存活期。

HIV表面約有10個(gè)由gp160組成的三聚體蛋白，在各類病毒中屬于較少的，從而增加了抗體的識(shí)別難度[3]。目前已有的廣譜中和抗體通常通過結(jié)合HIV表面gp160蛋白來捕獲病毒，同時(shí)可通過病毒膜上的脂質(zhì)或糖類以增強(qiáng)對(duì)病毒的鎖定[3]。由于突變的積累，廣譜中和抗體末端的互補(bǔ)決定區(qū)3(complementarity determining region 3，CDR3)比普通抗體長(zhǎng)，廣譜性增加，但突變也可能導(dǎo)致抗體不穩(wěn)定[3-4]，這是廣譜中和抗體面對(duì)變異迅速的HIV仍具有良好的控制病毒載量的原因之一。捕獲病毒后，廣譜中和抗體可通過自身介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、調(diào)理作用及激活補(bǔ)體等效應(yīng)來調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)完成對(duì)病毒的清除。相比其他小分子化合物，廣譜中和抗體的優(yōu)勢(shì)在于它能廣泛、特異性地結(jié)合并中和不同類型HIV，具有更強(qiáng)的抗病毒能力。因此，廣譜中和抗體不僅能結(jié)合抗原，發(fā)揮結(jié)合抗體的抗病毒效應(yīng)，還能通過IgG Fc片段發(fā)揮ADCC作用而參與抗病毒免疫反應(yīng)[5]。

2 HIV廣譜中和抗體的研發(fā)策略

2.1 抗原表位

大多數(shù)HIV廣譜中和抗體主要針對(duì)HIV唯一暴露的表面抗原，即花苞狀的包膜蛋白(gp120和gp41)，從而在病毒入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用。目前，主要通過構(gòu)建HIV表面包膜蛋白三聚體來誘導(dǎo)廣譜中和抗體[6]，而包膜蛋白三聚體的結(jié)構(gòu)往往是決定廣譜中和抗體能否有效發(fā)揮作用的關(guān)鍵，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)可能誘導(dǎo)廣譜中和抗體的靶點(diǎn)。

表1列出了一些HIV廣譜中和抗體，并根據(jù)其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了分類。這些靶點(diǎn)包括HIV gp120與CD4受體、CCR4協(xié)同受體、CXCR4協(xié)同受體的結(jié)合位點(diǎn)，gp120可變區(qū)V1、V2、V3的結(jié)合位點(diǎn)，以及gp41的一些結(jié)合位點(diǎn)[7-8]。 如針對(duì)HIV包膜蛋白的廣譜中和抗體PGT121、10E8正在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)[9-10]，N6正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)[11]。到目前為止，全世界只有一個(gè)抗HIV抗體被美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)通過[12]。2018年3月7日，F(xiàn)DA正式批準(zhǔn)HIV抗體ibalizumab-uiyk/TMB-355 (商品名：Trogarzo)上市，這是世界上首個(gè)被FDA批準(zhǔn)通過的抗HIV抗體，針對(duì)CD4受體，阻止HIV與CD4受體結(jié)合[13]。目前有很多廣譜中和抗體被開發(fā)并進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其他一些HIV治療抗體也在進(jìn)一步評(píng)估和探討中[11,14]。

表1 HIV廣譜中和抗體分類

Tab.1 Classification of HIV bNAbs

NameBreath(%)IC50(μg/mL)ReferenceCD4bindingsite B1235-752.821,15,16 HJ16368.011,17 VRC0188-930.091,18 CH103>50NA19 N6980.0920V1/V2 PG977-830.081,21 PGT145780.2922Glycan-V32G1228-391.451,23PGT121700.031,24PGT128720.021,25MPER 2F555-671.441,20,26 4E1085-1001.621,26 10E898-990.251,27 Z1335401,28

2.2 影響廣譜中和抗體產(chǎn)生的因素

影響廣譜中和抗體產(chǎn)生的因素包括宿主因素和病毒因素。在宿主方面，目前僅知廣譜中和抗體與慢性感染和重復(fù)感染有關(guān)。有一項(xiàng)研究分析能產(chǎn)生與不能產(chǎn)生廣譜中和抗體的HIV感染者，發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生廣譜中和抗體的個(gè)體可上調(diào)RAB11FIP5，且在NK細(xì)胞中表達(dá)最高，但機(jī)制尚不清楚[29]。對(duì)病毒方面了解甚少，但觀察到某些毒株可引起不同個(gè)體產(chǎn)生類似的廣譜中和抗體，這對(duì)研發(fā)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生廣譜中和抗體的HIV疫苗十分重要，但尚未篩選到相關(guān)病毒[30]。

2.3 誘導(dǎo)機(jī)制及免疫策略

抗病毒抗體研究中，早期一般通過向?qū)嶒?yàn)動(dòng)物注射抗原誘導(dǎo)體液免疫再分離血清而篩選獲得目標(biāo)抗體。這種方法并不能支撐廣譜中和抗體的篩選，尤其是全人源的廣譜中和抗體?，F(xiàn)在通常采用建立基因庫(kù)的方法進(jìn)行表達(dá)，從B細(xì)胞中將輕鏈和重鏈基因克隆出來，使用的B細(xì)胞可以是從天然感染人群中篩選的，也可以使用病毒樣顆粒等手段在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或健康人體內(nèi)誘導(dǎo)。而對(duì)于HIV廣譜中和抗體，研究人員最初是在天然感染者中發(fā)現(xiàn)并分離篩選到了能表達(dá)廣譜中和抗體的B細(xì)胞。目前，主要通過免疫誘導(dǎo)方式來篩選廣譜中和抗體。

研究人員在臨床上觀察到一個(gè)HIV感染者可能攜帶多種不同毒株，由此設(shè)想初始免疫不一定能引發(fā)足夠強(qiáng)的或足夠廣譜的免疫反應(yīng)來應(yīng)對(duì)不同毒株的感染[31]。雖然目前沒有任何證據(jù)表明中和能力和中和寬度與初始免疫和重復(fù)感染的時(shí)間間隔有關(guān)，但病毒攜帶兩種及以上病毒的時(shí)間間隔與中和寬度有關(guān)[32]。這些發(fā)現(xiàn)啟發(fā)了科研人員使用序貫免疫方法來開發(fā)廣譜中和抗體。按照一定的次序使用多種抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行免疫，誘導(dǎo)廣譜中和抗體并進(jìn)行篩選，可使研究人員不再過度依賴天然感染者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從而加快了廣譜中和抗體的研究進(jìn)程[33]。在序貫免疫用于廣譜中和抗體誘導(dǎo)之前，研究人員嘗試了各種誘導(dǎo)廣譜中和抗體的方法，希望找到針對(duì)保守表位的抗體，如使用能產(chǎn)生HIV包膜蛋白的DNA質(zhì)粒、不能復(fù)制的缺陷HIV顆粒、病毒樣顆粒構(gòu)建三聚體蛋白，以及使用佐劑來誘導(dǎo)廣譜中和抗體，但都失敗了[34]。有一項(xiàng)采用序貫免疫策略的研究，利用不同HIV毒株的病毒樣顆粒來誘導(dǎo)廣譜中和抗體，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，連續(xù)接種后動(dòng)物體內(nèi)的抗體水平不斷增加，且在多種不用HIV亞型連續(xù)接種的動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生了更強(qiáng)大的廣譜中和抗體反應(yīng)[35]。雖然序貫免疫表現(xiàn)出了優(yōu)異的誘導(dǎo)廣譜中和抗體的能力，但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)之間存在本質(zhì)性的差別，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平研制出的抗體在人源化后仍存在不確定性。此外，目前從大量抗體中篩選高效廣譜中和抗體與篩選各種小分子化合物藥物一樣，成本高且遙遙無期。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，未來通過計(jì)算機(jī)模擬來優(yōu)化篩選過程以提高篩選的準(zhǔn)確性，制訂最優(yōu)化的免疫順序，大大降低序貫免疫的成本，才是序貫免疫未來發(fā)展的趨勢(shì)。

2.4 評(píng)價(jià)體系

確定廣譜中和抗體是否研制成功，建立穩(wěn)定、適宜的抗體效能評(píng)價(jià)方法十分重要。恒河猴是猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)感染的天然宿主，疾病進(jìn)程與人感染HIV-1相似的，可在一定程度上反映慢病毒感染后宿主的免疫應(yīng)答特征。采用SHIV(SIV骨架與HIV-1包膜蛋白的嵌合病毒)建立的恒河猴感染模型，可誘導(dǎo)針對(duì)HIV-1包膜蛋白的體液免疫應(yīng)答，對(duì)HIV-1疫苗研發(fā)更具有借鑒意義。針對(duì)HIV-1膜蛋白的中和抗體假病毒評(píng)價(jià)體系，應(yīng)覆蓋國(guó)際通用序列(NIH AIDS Reagent Program提供的全球通用的12個(gè)HIV-1包膜蛋白參考序列克隆)，并覆蓋地域特異性流行性毒株，以評(píng)價(jià)HIV-1中和抗體的強(qiáng)度與廣度。具體評(píng)價(jià)指標(biāo)主要為抗體的保護(hù)能力，即抗體與病毒的結(jié)合能力和中和能力。在VRC01廣譜中和抗體測(cè)試中，研究人員采用了稱為“抗體介導(dǎo)預(yù)防”(antibody-mediated prevention，AMP)的方法，直接給測(cè)試對(duì)象注射抗體來觀察抗體的保護(hù)作用，以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的使用抗原誘導(dǎo)主動(dòng)免疫的方法[36]。這個(gè)理念正逐漸被接受。

2.5 分離方法

篩選廣譜中和抗體的一個(gè)重要前提是獲得足夠多的可供篩選的實(shí)驗(yàn)樣本，同時(shí)有足夠準(zhǔn)確的篩選方法將不能中和的抗體剔除，以減少假陽(yáng)性。目前，廣譜中和抗體的篩選方法主要有4種：噬菌體展示技術(shù)、B細(xì)胞永生化技術(shù)、單個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)直接功能篩選、抗體特異性的單個(gè)B細(xì)胞篩選。

2.5.1 噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)是一種將外源蛋白質(zhì)的編碼序列整合到噬菌體基因組中，以融合蛋白的方式表達(dá)于噬菌體表面的一種技術(shù)。其原理是將一段外源目的基因插入噬菌體中一個(gè)編碼特定外膜蛋白的基因中，使噬菌體的外殼膜蛋白能與外源DNA所編碼的蛋白形成融合蛋白，展示在噬菌體表面。該技術(shù)可在很大程度上將目的基因表達(dá)在噬菌體外殼膜蛋白的表面，并保持原有的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，還可獲得全人源單克隆抗體，減少甚至消除抗體在體內(nèi)的排異反應(yīng)。其局限性在于產(chǎn)生的抗體多樣性取決于噬菌體文庫(kù)的來源、多樣性和篩選過程[37]。

2.5.2 B細(xì)胞永生化技術(shù)1977年，研究者采用Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus)來介導(dǎo)轉(zhuǎn)化記憶B細(xì)胞，但效率非常低，很難得到大量抗原特異的B細(xì)胞[38]。2004年，研究者在轉(zhuǎn)化過程中加入多克隆抗體激動(dòng)劑，轉(zhuǎn)化效率大幅提升。該技術(shù)可使用少量細(xì)胞對(duì)抗體進(jìn)行篩選，且篩選到的細(xì)胞可直接進(jìn)行培養(yǎng)和增殖，以產(chǎn)生人源化的廣譜中和抗體。相比噬菌體展示技術(shù)，B細(xì)胞永生化技術(shù)篩選抗體通量更大，工作量更小，成本更低。早期的B12廣譜中和抗體就是使用該方法篩選的[39]。

2.5.3 基于單個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的篩選單個(gè)B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是近10年來抗體領(lǐng)域最常用的技術(shù)之一。其技術(shù)路線是將記憶B細(xì)胞單個(gè)分入96孔板，對(duì)每個(gè)孔單獨(dú)進(jìn)行中和測(cè)試，挑選陽(yáng)性孔行單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，測(cè)序，分離抗體，測(cè)試抗體的中和能力。該技術(shù)可根據(jù)不同需求分為隨機(jī)單個(gè)B細(xì)胞篩選和抗體特異的單個(gè)B細(xì)胞篩選。其優(yōu)勢(shì)在于保留了抗體可變區(qū)的天然配對(duì)，基因多樣性得到了保存，需要的細(xì)胞數(shù)量少，篩選效率高，可產(chǎn)生全人源抗體。但對(duì)設(shè)備要求相對(duì)較高，需流式細(xì)胞儀，尤其是進(jìn)行大規(guī)模篩選時(shí)。近年來，一些廣譜中和抗體如PG9和VRC01就是通過這種方法篩選獲得的[40]。

3 最新進(jìn)展

2017年，一篇發(fā)表于ScienceImmunology的研究開發(fā)了一種針對(duì)gp41的高效廣譜中和抗體10E8，能中和98%的HIV毒株，具有很好的開發(fā)潛力[41]。2018年，陳志偉等通過構(gòu)建串聯(lián)雙價(jià)廣譜中和抗體，獲得一種潛在的能預(yù)防和治療艾滋病的單克隆抗體[42]。他們發(fā)現(xiàn)，通過保留親本廣譜中和抗體的2個(gè)單鏈可變片段結(jié)合域，能有效提升中和寬度和效力，并在人源化小鼠中得到有效驗(yàn)證[42]。

4 結(jié)語(yǔ)

廣譜中和抗體的廣譜性意味著能中和盡可能多的毒株，但在提升廣譜性的同時(shí)出現(xiàn)共同抗原的概率大大增加，無形中給廣譜中和抗體的研發(fā)增加了難度。雖然目前尚無研究表明廣譜中和抗體能徹底清除體內(nèi)HIV，但能幫助控制艾滋病的發(fā)展，有效降低患者體內(nèi)病毒載量，這一具體機(jī)制尚未闡明[13]。由于廣譜中和抗體研制成本高，容易產(chǎn)生逃逸，至今難以用于臨床。近年來，隨著測(cè)序成本的降低及相關(guān)抗體生產(chǎn)技術(shù)的成熟，廣譜中和抗體的研發(fā)成本越來越低。此外，通過生物信息學(xué)方法對(duì)產(chǎn)生廣譜中和抗體的相關(guān)患者進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，也許能破解廣譜中和抗體產(chǎn)生之謎。

許多新技術(shù)的出現(xiàn)為HIV治療提供了新的思路和新的工具。如RNA熒光原位雜交(RNA fluorescenceinsituhybridization，RNA-FISH)可在細(xì)胞水平結(jié)合蛋白檢測(cè)mRNA，了解CD4+T細(xì)胞與HIV博弈過程中哪些mRNA處于活躍狀態(tài)，從而更加深刻地理解HIV感染過程和廣譜中和抗體誘導(dǎo)過程[43]。近年來，一直非常引人注目的基因編輯技術(shù)CRISPR和腫瘤領(lǐng)域非常熱門的CAR-T技術(shù)引起了HIV治療領(lǐng)域的關(guān)注。有一項(xiàng)旨在清除體內(nèi)病毒庫(kù)的CRISDPR研究設(shè)計(jì)了能廣泛識(shí)別HIV保守序列的CRISPR系統(tǒng)[44]。

目前采用單一手段治愈艾滋病存在極大的挑戰(zhàn)，多種策略聯(lián)合應(yīng)用將成為主流。希望全球各國(guó)政府及疫苗研發(fā)企業(yè)能共同合作，增加艾滋病研究領(lǐng)域所需的經(jīng)費(fèi)投入與政策支持，以期在全球范圍特別是在貧困地區(qū)更好地控制艾滋病疫情。