構(gòu)建表達(dá)Flag-GPI的重組乙型肝炎病毒載體

胡孔穎，谷陳建，吳敏樂，陶帥，劉楠楠，劉晶，謝幼華

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室，上海 200032； 2. 上海市浦東醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院檢驗科，上海 201399

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是重要的人類病原體，能感染人的肝實質(zhì)細(xì)胞，引起急性和慢性肝臟炎癥、肝纖維化、肝硬化和肝癌[1-6]。只有人類和少數(shù)靈長類動物的肝細(xì)胞對HBV具有易感性[7-8]。人肝細(xì)胞對HBV的易感性可歸于多種因素，包括肝細(xì)胞表面的受體以及肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白和其他因子。早期的研究顯示，肝細(xì)胞內(nèi)富集的轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控HBV的基因表達(dá)。2012年肝細(xì)胞特異的牛磺膽酸鈉共轉(zhuǎn)運多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)被鑒定為HBV的受體，極大地促進(jìn)了對HBV易感性的研究[9-11]。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的過表達(dá)人NTCP的人肝癌細(xì)胞系HepG2-NTCP能夠被HBV有效感染，為闡明HBV生活史提供了重要研究系統(tǒng)。但是在人肝癌細(xì)胞系Huh7細(xì)胞和未分化的HepaRG細(xì)胞中，過表達(dá)人NTCP后雖然可以造成HBV的感染，但是感染效率很低；在小鼠肝癌細(xì)胞系和大鼠肝癌細(xì)胞系如Hepa1-6、Hep56.1D和TC5123中，即使過表達(dá)人NTCP也不能使HBV有效感染[12-13]。并且，HBV感染HepG2-NTCP細(xì)胞系不僅要求有較高的感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，還需要聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的輔助[14]。因此，人肝細(xì)胞對HBV的易感性還需更深入的研究。

本課題組在前期研究中基于HBV臨床突變株6898構(gòu)建了具有較高復(fù)制能力的HBV載體5c3c。5c3c在包膜大蛋白preS1區(qū)缺失384bp，用以插入外源的基因片段，插入的外源基因可以利用其上游的Sp1啟動子啟動表達(dá)。此缺失部位包括preS1的C端和preS2的N端，位于不同開放讀碼框架的Spacer區(qū)域(圖1B)[15-16]。此外，還將HBV包膜大蛋白preS1的起始密碼子ATG突變?yōu)锳CG，以避免preS1殘留序列對下游插入的外源基因表達(dá)產(chǎn)生影響[15, 17]。本課題組前期在5c3c載體中插入了3種基因，分別是干擾素基因、shRNA的表達(dá)系統(tǒng)及ds-red基因，這些重組HBV載體不僅轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后能表達(dá)外源基因，且保留有較高的復(fù)制能力，在回補HBV包膜蛋白的情況下，能夠產(chǎn)生具有感染力的重組HBV(recombinant HBV，rHBV)[15]。

糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)是一種蛋白質(zhì)，通過翻譯后修飾而在其C端獲得的一個脂質(zhì)錨，被修飾的蛋白質(zhì)可以通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，暴露于細(xì)胞表面[18-21]。能夠獲得GPI修飾的蛋白N端和C端各含有一個信號肽，N端信號肽的作用是將蛋白質(zhì)帶到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)內(nèi)腔進(jìn)行加工；C端信號肽又被稱為GPI添加信號肽，其作用是用來替換預(yù)先在ER內(nèi)合成的GPI，使GPI通過特定的化學(xué)鍵連接在蛋白質(zhì)的C端[22-24]。

基于HBV載體5c3c和GPI的特性，本研究設(shè)想在5c3c載體中插入外源基因，該基因編碼帶有N端分泌信號肽和C端GPI添加信號肽的Flag標(biāo)簽，通過構(gòu)建表達(dá)Flag-GPI的重組HBV，使Flag標(biāo)簽表達(dá)在感染細(xì)胞的表面,從而可以利用Flag抗體對感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，進(jìn)而為HBV易感性提供研究工具[25-31]。

在本研究中，設(shè)計了兩個將Flag序列插入5c3c中的方案。第1個方案中，在5c3c的插入位點依次插入自帶起始密碼子(ATG)的N端信號肽序列，F(xiàn)lag編序列以及GPI添加信號肽序列；第2個方案中，將5c3c 載體中preS1的ACG突變回ATG，稱為5c3cT載體，利用preS1的N端充當(dāng)信號肽，在5c3cT中順序插入Flag和GPI添加信號肽序列。通過實驗驗證，最后得到重組HBV載體5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI。它們轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞和HepG2-NTCP細(xì)胞后，可以將其表達(dá)的Flag錨定在細(xì)胞膜上。這兩種重組HBV載體都保持一定的病毒復(fù)制能力，復(fù)制子5c3cT-Flag-GPI在回補HBV包膜蛋白的情況下，可以包裝形成完整的重組HBV顆粒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系293FT細(xì)胞系、Huh7細(xì)胞系由本實驗室保存，HepG2-NTCP細(xì)胞系[帶有滅瘟素(blasticidin S)抗性基因和人NTCP基因，在含blasticidin S的培養(yǎng)條件下能穩(wěn)定表達(dá)人NTCP的HepG2細(xì)胞系]由王勇翔副教授惠贈。

1.1.2 質(zhì)粒5c3c由本課題組保存，pCDNA3.1質(zhì)粒由吳可菲碩士惠贈，pRRL-cPPT-PGK-GPI-scFv-AB65-HIS質(zhì)粒由周保羅課題組惠贈，巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)-1.1-HBV(由CMV啟動子啟動的1.1拷貝的HBV基因組)由本課題組保存，p-LMS(可以表達(dá)HBV大、中、小3種包膜蛋白的質(zhì)粒)由崔曉嫻博士惠贈。

1.1.3 儀器和試劑主要儀器包括PCR儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、pH計(上海天達(dá)儀器有限公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)、EVOS倒置熒光顯微鏡(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)、Leica SP8 X激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)(德國Leica公司)、LSR Fortessa流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。主要試劑包括PrimeSTAR Max DNA Polymerase(TaKaRa公司)、Go Taq qPCR Master Mix(Promega公司)、快速質(zhì)粒小提試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、轉(zhuǎn)染試劑TurboFect(Thermo Fisher Scientific公司)、PCR DIG Probe Synthesis Kit(Roche公司)、DIG Easy Hyb Granules(Roche公司)、DMEM(Gibco公司)、胎牛血清(Gibco公司)、Trypsin-EDTA(Gibco公司)、流式細(xì)胞抗體APC anti-Flag(Biolegend公司)、免疫熒光抗體anti-Flag(Sigma公司)、抗-preS1抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.1.4 引物合成引物由上海桑尼生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物合成

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞均在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中用DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)培養(yǎng)，HepG2-NTCP細(xì)胞的培養(yǎng)需要在培養(yǎng)基中另加blasticidin S(5 μg/ml)。

1.2.2 免疫熒光細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗2次，每次5 min。加入含有1% Triton X-100的PBS破膜，室溫孵育10 min。用含5% BSA、0.1% Triton X-100的PBS孵育細(xì)胞，進(jìn)行封閉。棄去封閉液，用新配制的合適濃度的一抗孵育液(anti-Flag抗體按照1∶500～1 000 稀釋)室溫孵育2 h或4 ℃過夜。棄去一抗，PBS洗5次，每次5 min。配制合適濃度的二抗孵育液(一般按照 1∶500～1 000 稀釋)，室溫孵育1 h。棄去二抗，PBS洗5次，每次5 min。加入DAPI稀釋液，室溫孵育2 min。棄去DAPI，PBS洗5次，每次5 min。最后封片，置于熒光顯微鏡下觀察。檢測細(xì)胞膜表面抗原時PBS中不加入Triton X-100，其他步驟相同。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(針對6孔板的貼壁細(xì)胞)棄去舊的培養(yǎng)基后用PBS輕輕清洗細(xì)胞2遍，加入400 μl胰酶稀釋液(100 μl胰蛋白酶和300 μl PBS)，37 ℃下消化5～10 min。加入800 μl DMEM(含10% FBS，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)終止消化作用，重懸吹散后350 g離心5 min。用PBS重懸，對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)后分裝到1.5 ml的EP管中，使每管約含(5～10)×105個細(xì)胞。加入5 μl封閉液，室溫封閉10 min。加入2 μl 0.2 μg/μl的APC anti-Flag抗體，冰上避光孵育20 min。用PBS洗2次，每次350 g離心5 min，收集細(xì)胞。用500 μl PBS重懸后上流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 Southern印跡法配制質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠，上樣，70 V電泳約2 h。取出膠，用變性液變性1 h。完成后，用中和液中和1 h。結(jié)束后，將凝膠、裁剪好的尼龍膜、濾紙浸泡入20×SSC中。轉(zhuǎn)膜過夜后，將尼龍膜在2×SSC溶液中浸泡5 min，接著紫外交聯(lián)2 min。將尼龍膜放入圓柱形管中，加入5 ml的預(yù)雜交液， 42 ℃預(yù)雜交30 min。取出探針，100 ℃變性5 min，迅速冰浴3 min。將探針加入新的預(yù)雜交液中，配制形成雜交液。倒出預(yù)雜交液，換成雜交液， 42 ℃雜交6～8 h。高鹽溶液洗膜2次，每次5 min。低鹽溶液洗膜2次，每次15 min。接下來在雜交爐中的步驟溫度都為 25～50 ℃。Washing緩沖液潤洗1～5 min。Blocking 緩沖液封閉30 min。anti-DIG antibody溶液孵育30 min。Washing緩沖液洗2次，每次15 min。Detection緩沖液潤洗2～5 min。在尼龍膜上覆蓋CSPD工作液，室溫避光5 min。發(fā)光，30 min以上。

2 結(jié)果

2.1 Flag-GPI表達(dá)載體的構(gòu)建

通過GPI錨將蛋白錨定在細(xì)胞膜上并暴露于細(xì)胞膜外側(cè)，需要目的蛋白(多肽)的N端和C端各含有一個信號肽。根據(jù)文獻(xiàn)，選取了2個N端信號肽序列，分別命名為Bip和CD59。Bip信號肽序列來源于分泌表達(dá)載體pSecTag2A-Bip，其上Bip的作用是將所表達(dá)的蛋白引導(dǎo)入ER的分泌途徑。CD59是補體調(diào)節(jié)蛋白CD59的N端信號肽，CD59本身通過GPI錨而被錨定在細(xì)胞膜表面[32]。C端的GPI添加信號肽的基因序列采用了周保羅課題組惠贈的載體質(zhì)粒pRRL-cPPT-PGK-GPI-scFv-AB65-HIS上的GPI添加信號肽基因序列。每個N端信號肽都含有起始密碼子(ATG)，GPI添加信號肽的C端含有終止密碼子(TGA)。

在真核表達(dá)載體pCDNA3.1中，選擇在EcoRⅠ與BamHⅠ之間的酶切位點插入N端信號肽基因序列、Flag編碼序列和C端GPI添加信號肽基因序列。為增強插入基因的翻譯，在N端信號肽的起始密碼子(ATG)前插入了Kozak序列(圖1A)。同時，也構(gòu)建了不含N端信號肽序列的對照質(zhì)粒，即在pCDNA3.1載體中僅插入Flag編碼序列和C端GPI添加信號肽，在Flag前端帶有Kozak序列和起始密碼子ATG(圖1A)。以上這些質(zhì)粒分別被命名為pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI，pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI和pCDNA3.1-Flag-GPI。

在含有1.1拷貝HBV基因組的5c3c載體質(zhì)粒上進(jìn)行了同樣的操作，構(gòu)建了5c3c-Bip-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI(圖1C)。

5c3c載體上preS1仍保留其在N端的11個氨基酸的編碼序列。HBV包膜大蛋白preS1的N端在天然情況下可被豆蔻酰化，因此可能含有將其定向帶到ER的N端信號肽?；谠撏茢?，將5c3c載體中preS1的突變起始密碼子ACG變回ATG，新的載體命名為5c3cT。隨后將Flag編碼序列和GPI添加信號肽序列依次插入5c3cT載體中(圖1C)。該載體質(zhì)粒被命名為5c3cT-Flag-GPI。

A: The sequences coding the N-signal peptide (Bip or CD59), Flag, and GPI-addition signal peptide (GPI) were inserted respectively into the vectors pCDNA3.1. B: The organization of the 5c3c vector. C: The sequences coding the N-signal peptide (Bip or CD59), Flag, and GPI-addition signal peptide (GPI) were inserted respectively into the vectors 5c3c and 5c3cT. The mutated preS1 start codon (ACG) in 5c3c was reverted to ATG in 5c3cT.

圖1 Flag-GPI表達(dá)載體構(gòu)建示意圖

Fig.1 Schematic presentation of Flag-GPI constructs

2.2 Flag-GPI的細(xì)胞表面錨定驗證

免疫熒光實驗結(jié)果顯示，pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞(圖2A)和293FT細(xì)胞(圖2B)后，可將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞表面。陰性對照pCDNA3.1-Flag-GPI在細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)Flag，但不能將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞表面(圖2A和2B)。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步證實pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，細(xì)胞表面Flag陽性的細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖2C)。

將5c3c-Bip-Flag-GPI、5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后進(jìn)行免疫熒光實驗，發(fā)現(xiàn)5c3c-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表面可檢測到Flag標(biāo)簽(圖3A)，而5c3c-Bip-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后不表達(dá)Flag(結(jié)果未展示)，5c3cT-Flag-GPI轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞表面也呈現(xiàn)Flag陽性(圖3A)。免疫熒光實驗結(jié)果也證明，轉(zhuǎn)染5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI的 HepG2-NTCP細(xì)胞表面也能檢測到Flag標(biāo)簽(圖3B)。流式細(xì)胞檢測結(jié)果進(jìn)一步表明，5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞膜上(圖3C)。

2.3 表達(dá)Flag-GPI的重組HBV具有復(fù)制能力

用DNA印跡法(Southern印跡法)驗證獲得的兩個重組HBV復(fù)制子轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后能否有效復(fù)制。實驗結(jié)果表明，5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI均能復(fù)制(圖4)。如圖4所示，在復(fù)制能力上空載體5c3c的最強，5c3cT-Flag-GPI與CMV-1.1-HBV相當(dāng)，5c3cT-Flag-GPI比5c3c-CD59-Flag-GPI強。

由于5c3cT-Flag-GPI的復(fù)制能力比5c3c-CD59-Flag-GPI強，因此采用5c3cT-Flag-GPI進(jìn)行進(jìn)一步的實驗。在Huh7細(xì)胞中共轉(zhuǎn)表達(dá)HBV表面蛋白的p-LMS質(zhì)粒和5c3cT-Flag-GPI質(zhì)粒，純化和濃縮細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，用抗preS1的抗體進(jìn)行pull-down實驗，判斷有無完整的重組HBV產(chǎn)生(圖5)。共轉(zhuǎn)p-LMS質(zhì)粒和5c3c載體作為陽性對照，單轉(zhuǎn)5c3c載體作為陰性對照。實驗結(jié)果顯示，5c3cT-Flag-GPI在回補HBV包膜蛋白后，可產(chǎn)生完整的重組HBV顆粒。

A: Transfections of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI into Huh7 cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. B: Transfections of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI into 293FT cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. C: Flow cytometry analysis. Surface-displayed Flag positive cells were detected and selected by anti-Flag antibodies.

圖2 pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞表面

Fig.2 Anchorage of Flag tags on the cell membrane after transfection of pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI and pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI

A: Transfections of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI into Huh7 cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. B: Transfections of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI into HepG2-NTCP cells. pCDNA3.1-Flag-GPI served as negative control. C: Flow cytometry analysis. Surface-displayed Flag positive cells were detected and selected by anti-Flag antibodies.

圖3 5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞表面

Fig.3 Anchorage of Flag tags on the cell membrane after transfection of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI

From the left to the right, the samples are 5c3c, CMV-1.1-HBV, 5c3cT-Flag-GPI, 5c3c-CD59-Flag-GPI, and blank control. 5c3c and CMV-1.1-HBV served as positive controls. Blank control served as a negative control.

圖4 Southern印跡法驗證5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI的復(fù)制能力

Fig.4 The replication ability of 5c3cT-Flag-GPI and 5c3c-CD59-Flag-GPI verified by Southern blot

Cotransfection of 5c3c and p-LMS with pull-down assays served as positive control, transfection of 5c3c with pull-down assays served as negative control.

圖5 Pull-down實驗驗證重組HBV的產(chǎn)生

Fig.5 Verification of formation of recombinant HBV particles with pull-down assays

3 討論

在本研究中，首先在pCDNA3.1載體上獲得pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和 pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI，轉(zhuǎn)染Huh7和293FT細(xì)胞后可將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞表面(圖2)。這兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞后，進(jìn)行對細(xì)胞膜穿孔和未穿孔的免疫熒光實驗。結(jié)果顯示，被穿孔的293FT細(xì)胞，細(xì)胞膜上有明顯的穿孔痕跡，細(xì)胞膜表現(xiàn)為不連續(xù)的點狀綠色熒光。推測與蛋白質(zhì)相連的GPI錨(兩個疏水的脂肪酸長鏈)大多插入在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)筏區(qū)域，該區(qū)域的穩(wěn)定性較高，不溶于Triton X-100。因此在采用Triton X-100對細(xì)胞膜進(jìn)行穿孔時，脂質(zhì)筏區(qū)域不能被Triton X-100“穿透”，所以錨定有Flag而未被Triton X-100消化的脂質(zhì)筏就呈現(xiàn)為不連續(xù)的點狀綠色熒光[33-34]。然而對比觀察pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI和pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后被Triton X-100穿孔后的免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Huh7的細(xì)胞膜偶爾會出現(xiàn)不連續(xù)的點狀綠色熒光，更多的是直接觀察到細(xì)胞內(nèi)核周圍的綠色熒光，這與293FT細(xì)胞上所觀察到的結(jié)果并不完全一致。原因可能是293FT細(xì)胞和Huh7細(xì)胞的細(xì)胞膜磷脂雙分子中脂質(zhì)筏的比例可能不一樣， 293FT細(xì)胞膜磷脂雙分子層中脂質(zhì)筏的比例可能高于Huh7細(xì)胞膜中的，293FT細(xì)胞的細(xì)胞膜更難被Triton X-100消化，因此穿孔后293FT細(xì)胞的細(xì)胞膜更多呈現(xiàn)為不連續(xù)的點狀綠色熒光。

pCDNA3.1-Bip-Flag-GPI 和 pCDNA3.1-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7和293FT細(xì)胞后可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞膜上說明Bip和CD59可以正常發(fā)揮信號肽的功能，并且與Flag C端的GPI添加信號肽協(xié)同作用，協(xié)助將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞膜上。但是將這兩個N端信號肽對應(yīng)插入在載體5c3c上，就只有5c3c-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞膜上，而5c3c-Bip-Flag-GPI不能在轉(zhuǎn)染的Huh7細(xì)胞中表達(dá)Flag標(biāo)簽(結(jié)果未展示)。此現(xiàn)象說明即使在pCDNA3.1載體上可以正常發(fā)揮作用的N端信號肽在5c3c載體上也不一定具有活性。可能是因為5c3c載體更為復(fù)雜，插入的N端信號肽在HBV基因組中發(fā)揮功能尚需具備一定的兼容性。本研究的目的之一是使Flag標(biāo)簽在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)可以通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，但是否表達(dá)Flag標(biāo)簽的細(xì)胞都能有效地將Flag進(jìn)行GPI修飾進(jìn)而錨定在細(xì)胞膜上還需要進(jìn)一步的研究，后續(xù)實驗將檢測Flag 膜錨定細(xì)胞數(shù)占Flag陽性細(xì)胞數(shù)的百分比，從而衡量GPI修飾效率和(或)Flag-GPI細(xì)胞膜錨定的效率。

載體5c3cT-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后也可以將Flag標(biāo)簽錨定在細(xì)胞膜上，證明5c3c中殘留的preS1序列確實具有N端信號肽的作用。HBV載體的相關(guān)研究也表明，HBV基因組的長度越短，該載體的復(fù)制能力則往往越強[16]。復(fù)制子5c3cT-Flag-GPI的基因組長度比復(fù)制子5c3c-CD59-Flag-GPI的短，但其復(fù)制能力比復(fù)制子5c3c-CD59-Flag-GPI的強，進(jìn)一步驗證了這一觀點。

本研究基于課題組前期工作基礎(chǔ)和GPI錨的相關(guān)特性，構(gòu)建了重組HBV載體5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI，轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后可將Flag標(biāo)簽通過GPI錨定在細(xì)胞膜上，并可利用Flag抗體通過流式細(xì)胞術(shù)對表面含有Flag標(biāo)簽的細(xì)胞進(jìn)行分選。5c3cT-Flag-GPI和5c3c-CD59-Flag-GPI轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后都能進(jìn)行復(fù)制，證明其都能產(chǎn)生完整的病毒核心顆粒。在反式回補HBV的包膜蛋白之后，5c3cT-Flag-GPI可以產(chǎn)生完整的重組HBV。因為產(chǎn)生的重組HBV滴度較低，所以重組HBV未能有效感染HepG2-NTCP細(xì)胞(結(jié)果未展示)。由圖5可知在共轉(zhuǎn)5c3cT-Flag-GPI和p-LMS未進(jìn)行pull-down的情況下，復(fù)制子5c3cT-Flag-GPI的復(fù)制能力很強，說明此時可以產(chǎn)生大量的HBV核心顆粒；但是在共轉(zhuǎn)5c3cT-Flag-GPI和p-LMS進(jìn)行pull-down時，形成完整重組HBV顆粒的滴度卻很低。該現(xiàn)象提示包裝形成的重組HBV滴度不高的原因可能是重組HBV的包裝系統(tǒng)不夠高效。提示后續(xù)實驗將改進(jìn)包膜蛋白的提供方式來對重組HBV的包裝體系進(jìn)行優(yōu)化，本課題組以往的包裝系統(tǒng)采用反式提供HBV的包膜蛋白，但是包裝效率不高。考慮到HBV的特性，順式提供其包膜蛋白將是我們優(yōu)化包裝體系的一個重要研究方向。總的來說，本研究為進(jìn)一步優(yōu)化Flag-GPI重組HBV包裝體系和感染實驗奠定了基礎(chǔ)。