潘傳燕,林 勇,馮鵬霏,張永德,羅洪林
(廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院 廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530021)
熱休克同源蛋白Hsc70(heat shock cognate 70 ku protein)是熱休克蛋白Hsp 70家族(heat shock proteins, Hsp70)的成員之一,也稱Hsp73,是一種結(jié)合蛋白。Hsc70由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:一個(gè)結(jié)構(gòu)域(N端)是相對(duì)分子質(zhì)量為44 ku的三磷苷酶(ATPase)功能域,該區(qū)域高度保守,是ATP的結(jié)合位點(diǎn);另一個(gè)結(jié)構(gòu)域(C端)是一個(gè)25 ku的區(qū)域,該區(qū)域包含3個(gè)部分:多肽結(jié)合功能域、靠近C末端的可變區(qū)和C末端的基序。Hsc70和Hsp70具有高度的序列同源性(95%)和相似的生物化學(xué)特性。Hsc70在所有正常細(xì)胞內(nèi)均能表達(dá), 環(huán)境刺激(如細(xì)菌感染、高溫等)后其表達(dá)量有不同程度的增加[1-2]。Hsc70存在于原核及真核生物細(xì)胞中,具有多種生物學(xué)功能:作為分子伴侶促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、定位、組裝等[3];參與免疫調(diào)節(jié)[4];參與細(xì)胞的生命歷程,如細(xì)胞分裂、分化和凋亡[5-7];參與細(xì)胞抗氧化,有效保護(hù)細(xì)胞免受氧化及炎癥反應(yīng)帶來的傷害[8]等。此外,王宇萍[9]指出:Hsc70的表達(dá)水平與HBV的復(fù)制呈正相關(guān),Hsc70可能成為抗HBV的新型藥物靶點(diǎn)。Hsc70 在不同組織中的表達(dá)量具有差異性,這一特點(diǎn)已經(jīng)在斑馬魚、鯉魚、黃顙魚和虹鱒等魚類中得到證實(shí)[2,10-12]。
羅非魚具有多種優(yōu)良的養(yǎng)殖性狀,受到世界各國養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的青睞。我國是羅非魚養(yǎng)殖大國,但細(xì)菌性疾病的暴發(fā)給我國羅非魚產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,并沖擊了我國羅非魚產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。羅非魚自身的抗應(yīng)激能力是抵御細(xì)菌感染、應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的關(guān)鍵因素,決定了養(yǎng)殖成活率和養(yǎng)殖效益。Hsc70基因作為一種重要的看家基因,與生物體的抗逆抗應(yīng)激能力密切相關(guān), 影響機(jī)體的存活能力和生長(zhǎng)速率[5]。目前,部分魚類的Hsc70已被成功克隆,如黃顙魚、大菱鲆、南方鲇、虹鱒、青鳉、松江鱸、巖原鯉等。張娟等[2]發(fā)現(xiàn)黃顙魚Hsc70呈組成型表達(dá),在多種組織中均有表達(dá),但表達(dá)量有差異。高海霞[13]成功構(gòu)建了松江鱸Hsc70的原核表達(dá)載體,并獲得了其重組蛋白。研究表明,Hsc70受到高溫、重金屬、細(xì)菌感染等外界刺激時(shí),會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14-15]。關(guān)于尼羅羅非魚Hsc70的原核表達(dá)和多抗制備還未見報(bào)道。因此,本研究利用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建尼羅羅非魚Hsc70表達(dá)載體,分析其重組蛋白的表達(dá)情況,制備多克隆抗體,以期為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚Hsc70的功能奠定基礎(chǔ)。
尼羅羅非魚cDNA、質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室制備;蛋白原核表達(dá)載體pET-B2m(由pET-28a改造而來)和轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌B21均為武漢金開瑞生物工程有限公司產(chǎn)品;T4 DNA Ligase、DNA聚合酶、蛋白marker、限制性內(nèi)切酶購自美國Fermentas公司;誘導(dǎo)劑IPTG購自德國默克公司,弗式完全佐劑、弗氏不完全佐劑是美國Sigma公司的產(chǎn)品;PVDF膜購自ThermoFisher公司;羊抗兔-HRP抗體購自美國Jackson公司;DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京);Ni-NTA親和層析樹脂購自GE Healthcare公司。
1.2.1 抗原預(yù)測(cè)
采用在線分析工具ExPASy中的ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)Hsc70蛋白質(zhì)疏水性,TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測(cè)Hsc70蛋白序列的跨膜區(qū)間。使用DNAstar軟件預(yù)測(cè)Hsc70蛋白的親水性、抗原指數(shù)等。采用Swiss-model在線分析軟件(https://swissmodel.expasy.org)對(duì)Hsc70蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模。
1.2.2Hsc70基因擴(kuò)增與原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
根據(jù)尼羅羅非魚Hsc70基因序列(NCBI登錄號(hào):XP 003455104.1),利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,上游引物序列為5′-TCCACTGGGTTCTCGGACTATGAGCAAAGGTCCGG-3′;下游引物序列為5′-TAAGGCCGCACTCGAGCACCACATCAACTTCTTCAATT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性 45 s,52 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 45 s,共28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行切膠回收。
將PCR產(chǎn)物和載體用SalⅠ與BamHⅠ進(jìn)行雙酶切處理后,將目的片段與載體連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-B2m-Hsc70,轉(zhuǎn)入大腸埃希菌B21;篩選含有Amp+的陽性克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。
1.2.3 重組蛋白的原核表達(dá)及純化
將重組質(zhì)粒(pET-B2m-Hsc70)轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株B21,在含有Amp+(100 g·mL-1)的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布,37 ℃振蕩培養(yǎng)至D600為0.6,之后培養(yǎng)溫度降至30 ℃;加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.5 mmol·L-1,30 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h。收集菌液,6 000g離心10 min收集菌體。用冰浴超聲波破碎細(xì)菌,在4 ℃的低溫條件下20 000g離心30 min,收集上清和沉淀,SDS-PAGE電泳檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況和可溶性。
在Ni-NTA樹脂層析柱中緩慢加入收集的誘導(dǎo)表達(dá)菌,流速為0.5 mL·min-1,收集穿柱液體。層析用 10倍柱床體積的NTA-0緩沖液沖洗,流速控制在1 mL·min-1左右,接著分別用10倍柱床體積的NTA-20、NTA-60、NTA-200、NTA-500緩沖液洗脫,控制流速約1 mL·min-1,收集各洗脫液,通過SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的純度,紫外吸收法檢測(cè)純化蛋白的濃度。純度達(dá)到要求的組分,于透析袋中4 ℃以1×PBS進(jìn)行透析,最后于4 ℃超濾濃縮透析產(chǎn)物,用5 mL 8 mol·L-1的尿素溶液溶解目的蛋白。
1.2.4 多克隆抗體制備、效價(jià)檢測(cè)
取2只日本大耳兔,耳靜脈采血作為免疫前血清。純化后的重組蛋白與等容積的弗氏完全佐劑混合,采用皮下多點(diǎn)注射法按每只500 μg的劑量免疫2只日本大耳白兔。每只兔子至少經(jīng)過4次免疫,根據(jù)免疫效價(jià),評(píng)估是否進(jìn)行第5次、第6次的免疫,每次免疫中間隔14 d。免疫7 d后,耳靜脈采血,用間接ELISA法檢測(cè)血清中抗體的效價(jià)。
重組Hsc70蛋白(2 μg·mL-1)按每孔100 μL的量加入96孔板中進(jìn)行抗原包被,4 ℃過夜;將待檢血清按1∶2 000、1∶4 000作二倍梯度稀釋至1∶32 768 000,稀釋液作為一抗,各稀釋梯度取100 μL至96孔板中,以免疫前血清作為陰性對(duì)照;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗。每個(gè)反應(yīng)孔用TMB顯色液100 μL顯色20 min,之后加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的D值。出現(xiàn)陽性反應(yīng)的最大稀釋度即是待測(cè)樣品的效價(jià)。
1.2.5 抗體純化
采用Protein G親和層析柱對(duì)Hsc70蛋白多克隆抗體進(jìn)行純化,詳細(xì)操作步驟見張永德等[16],將抗血清與2×PBS緩沖液等體積混合,經(jīng)10倍柱體積以上的PBS洗滌,至流出液無蛋白檢出,加入2倍柱體積0.1 mol·L-1檸檬酸(pH 2.7)洗脫,收集洗脫產(chǎn)物,純化所得的抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.6 Western blot檢測(cè)
取25 ng和10 ng純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電泳后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜,于封閉液中封閉2 h。加入制備的多克隆抗體(1∶1 000),37 ℃孵育1 h;洗滌后再用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h后進(jìn)行顯色反應(yīng),取出拍照分析抗體的特異性。
根據(jù)蛋白的二級(jí)機(jī)構(gòu)、B細(xì)胞表位、跨膜序列、疏水性等參數(shù)的分析(圖1),Swiss-model構(gòu)建的Hsc70 3D模型見圖2。結(jié)果顯示,Hsc70基因編碼蛋白由646個(gè)氨基酸組成,從重組蛋白表達(dá)來看,無跨膜區(qū),無信號(hào)肽序列,親水性好,抗原指數(shù)得分也適中,可以引起較好的免疫。
以重組質(zhì)粒pET-B2m-Hsc70為模板,擴(kuò)增Hsc70基因,擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得一條1 938 bp的目的條帶(圖3),與預(yù)期大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示:連接到載體中的目的序列與NCBI上的序列一致,且方向正確,確定Hsc70基因已正確插入載體pET-B2m中,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
對(duì)重組蛋白進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)條件為:
圖1 尼羅羅非魚Hsc70抗原表位分析Fig.1 Analysis of epitope of Hsc70 in Nile tilapia
圖2 Hsc70三級(jí)結(jié)構(gòu)建模Fig.2 Hsc70 tertiary structure modeling
M,DL2000;1,Hsc70。圖3 Hsc70基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification of Hsc70
M,蛋白標(biāo)準(zhǔn);1~2,其他蛋白;3,表達(dá)菌上清;4,表達(dá)菌沉淀。M, Marker;1~2, Other proteins; 3, The supernatant of expressed proteins;4, The precipitate of expressed proteins.圖4 重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant protein
誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.5 mmol·L-1,誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h后收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果如圖4,上清液與沉淀均在75 ku處出現(xiàn)蛋白條帶,且沉淀的蛋白條帶較上清液粗,沉淀中的目的蛋白含量顯著高于上清液(圖4),說明重組蛋白主要存在于沉淀中,目的蛋白主要以包涵體的形式存在。
重組Hsc70蛋白主要以包涵體的形式存在,利用Ni-NTA樹脂層析柱純化目的蛋白。純化后的重組蛋白經(jīng)10倍稀釋后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示,在75 ku處有一條清晰的條帶(圖5)。純化后重組蛋白的純度達(dá)到90%,濃度為2 mg·mL-1,是適合免疫日本大耳兔的抗原。
M,蛋白標(biāo)準(zhǔn);1,Hsc70。M, Marker;1, Hsc70.圖5 重組蛋白純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein
以免疫前血清作為陰性對(duì)照,免疫7 d后,耳靜脈采血,用間接ELISA法檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià)。結(jié)果如圖6,抗體的效價(jià)為 1∶2 048 000,說明該重組蛋白能誘導(dǎo)日本大耳兔產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。
圖6 Hsc70多克隆抗體的ELISA曲線Fig.6 ELISA curves of Hsc70 polyclonal antibody
收集的抗血清經(jīng)Protein G親和層析柱純化后,通過SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果顯示,在約50 ku和25 ku處均出現(xiàn)一條清晰的蛋白條帶(圖7)。純化后的抗體純度大于85%,濃度為10 mg·mL-1,抗體純化效果良好。
純化后的重組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè),結(jié)果見圖8,25 ng和10 ng重組蛋白均在約75 ku處出現(xiàn)一條清晰蛋白條帶,且25 ng蛋白條帶較10 ng的蛋白條帶粗,而免疫前血清對(duì)照組在相應(yīng)位置無特異性條帶,不存在特異性反應(yīng),表明Hsc70抗血清具有較高的特異性。
M,蛋白標(biāo)準(zhǔn);1,Hsc70抗體。M, Marker; 1, Hsc70 polyclonal antibody.圖7 Hsc70抗體純化結(jié)果Fig.7 Analysis of purified products of Hsc70 polyclonal antibody
M,蛋白標(biāo)準(zhǔn);1,10 ng Hsc70重組蛋白;2,25 ng Hsc70重組蛋白;3,陰性對(duì)照。M, Marker; 1, 10 ng Hsc70 recombinant protein; 2, 25 ng Hsc70 recombinant protein; 3, Negative control.圖8 Western blot印跡分析多克隆抗體的特異性Fig.8 Specificity of polyclonal antibody by Western blot assays
Hsp70是熱休克蛋白中最保守、最重要,也是研究最深入的蛋白質(zhì)家族之一,能在各種外界刺激如溫度脅迫、鹽度脅迫、溶解氧脅迫、微生物感染等的誘導(dǎo)下表達(dá)。Hsc70是Hsp70家族的結(jié)構(gòu)型蛋白成員之一,含有較多的內(nèi)含子,具有管家基因的功能,研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠體內(nèi)的Hsc70基因,小鼠細(xì)胞無法存活[17]。在正常環(huán)境下,Hsc70為組成型表達(dá)[18],受到外界刺激時(shí)為誘導(dǎo)表達(dá),這一點(diǎn)已在部分魚類得到驗(yàn)證,如病原感染能誘導(dǎo)大菱鲆Hsc70表達(dá)[19],熱刺激可誘導(dǎo)黃顙魚Hsc70表達(dá)[2]。目前,已在多種生物中克隆出Hsc70,如近江牡蠣、草魚、孔雀魚、豆卜饃夜蛾、中華鱉、凡納濱對(duì)蝦等[4,20-24]。鄭薇薇[25]首次克隆了棉鈴蟲Hsc70,并證實(shí)20-羥基蛻皮酮可誘導(dǎo)Hsc70入核表達(dá)。馮冰冰等[26]從縊蟶中獲得了Hsc70亞家族基因并命名為ScHsc70,ScHsc70基因可能參與了對(duì)細(xì)菌感染的防御反應(yīng)。章海濱等[5]克隆出巖原鯉Hsc70,其氨基酸序列與草魚的有100%同源性,巖原鯉Hsc70基因的表達(dá)存在明顯的組織差異性。Li等[27]報(bào)道,中國軟殼海龜受熱刺激后,Hsc70轉(zhuǎn)錄水平會(huì)迅速上調(diào),其蛋白相對(duì)表達(dá)量增加數(shù)十倍。
多克隆抗體是用一種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動(dòng)物,該動(dòng)物機(jī)體所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體,所獲得的免疫血清實(shí)際上是含有多種抗體的混合物。制備多克隆抗體過程較簡(jiǎn)單,直接用抗原免疫動(dòng)物,經(jīng)過3~4次免疫,ELISA檢測(cè)效價(jià),收集抗血清,純化后即可得到多克隆抗體。制備高效價(jià)的抗體是檢測(cè)基因表達(dá)和研究基因功能的重要前提[28]。多克隆抗體具有制備周期短、技術(shù)要求不高、穩(wěn)定性較好、能識(shí)別多個(gè)表位、制備成本較低等優(yōu)點(diǎn),廣泛使用于多個(gè)科研領(lǐng)域[29],如常用于變性蛋白的檢測(cè),石蠟包埋組織切片的染色,相應(yīng)抗原的標(biāo)記,農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè),病原物的檢測(cè)、疾病的診斷及治療等。多克隆抗體因制備較簡(jiǎn)單和用途廣泛而在細(xì)菌、病毒、動(dòng)植物等多種生物開展研究,通過制備多克隆抗體為進(jìn)一步研究相關(guān)蛋白的功能做準(zhǔn)備。洪偉鳴等[30]制備了單增李斯特菌溶血素(listeriolysiono,LLO)多克隆抗體;畢莊莉等[31]獲得了效價(jià)高、特異性好的新型鴨呼腸孤病毒σC蛋白的多克隆抗體;彭琪琪等[32]制備了一個(gè)植物半胱氨酸蛋白酶的多克隆抗體等。本研究利用大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)尼羅羅非魚Hsc70蛋白,通過純化包涵體蛋白并免疫日本大耳兔獲得了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的多克隆抗體。
在制備抗體前對(duì)目的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,有利于提高抗體制備的成功率。Hsc70基因結(jié)構(gòu)上高度保守,經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析,編碼646個(gè)氨基酸,無跨膜區(qū),無信號(hào)肽序列,親水性好,抗原表位較好,適合用于抗原抗體制備。本研究在對(duì)Hsc70進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,表達(dá)全長(zhǎng)蛋白進(jìn)行多抗免疫,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,全長(zhǎng)表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性,獲得的多克隆抗體,效價(jià)達(dá)1∶2 048 000,且能特異性的識(shí)別尼羅羅非魚Hsc70蛋白。本研究獲得的重組蛋白和多克隆抗體為Hsc70功能研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。