一株分離自雞肉樣品的多重耐藥大腸埃希菌的全基因組測(cè)序及耐藥性研究

常 江，羅 怡，唐 標(biāo)，張 玲，戴賢君，裘罕琦，楊 華，夏效東

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.中國計(jì)量大學(xué) 現(xiàn)代科技學(xué)院，浙江 杭州 310018)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是一種常見的革蘭氏陰性短桿菌，周生鞭毛和菌毛，是一種重要的水源和食品糞便污染指示菌[1]。大腸埃希菌常見于人與動(dòng)物腸道中，是一種條件致病菌，部分大腸埃希菌可以產(chǎn)生腸毒素，使嬰幼兒出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉[2]。目前活禽買賣交易已經(jīng)在國內(nèi)大多數(shù)城市被禁止[3]，冷鮮雞因其肉質(zhì)鮮嫩、口感細(xì)膩、營養(yǎng)保留完整等優(yōu)點(diǎn)日益受到消費(fèi)者的歡迎[4]。然而，抗生素因其促生長及預(yù)防疾病的作用被廣泛應(yīng)用于禽類養(yǎng)殖中，在提高禽肉產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的同時(shí)也導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性問題的出現(xiàn)，引起了人們極大的關(guān)注[5]。大腸埃希菌作為重要的耐藥基因儲(chǔ)藏庫，其攜帶的耐藥基因可以通過食物鏈或直接接觸的方式進(jìn)行傳播。同時(shí)，存在于大腸埃希菌中的耐藥基因可以通過水平基因元件(包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等)等發(fā)生垂直和水平傳播，使得細(xì)菌耐藥性發(fā)生進(jìn)一步的擴(kuò)散[6-7]。雞肉從養(yǎng)殖到屠宰、運(yùn)輸再到消費(fèi)者餐桌上的產(chǎn)業(yè)鏈中會(huì)攜帶大量的耐藥細(xì)菌，對(duì)食品安全和人們的健康產(chǎn)生很大的威脅[8-10]。

本實(shí)驗(yàn)以在對(duì)雞肉樣本大腸埃希菌監(jiān)測(cè)中分離到的一株多重耐藥大腸埃希菌為研究對(duì)象，獲得了其全基因組完成圖并進(jìn)行了序列分析，預(yù)測(cè)了其可能的多重耐藥機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為雞肉污染微生物耐藥性評(píng)估提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大腸埃希菌分離

在浙江省寧波市具有代表性的幾個(gè)大型超市及農(nóng)貿(mào)市場中采集冷鮮雞樣品20份，根據(jù)《GB4789.38—2012食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》初步分離鑒定大腸埃希菌。將采集到的冷鮮雞樣品放入含有10 mL緩沖蛋白胨水(BPW)的無菌袋中，充分混勻，36 ℃培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)得到的BPW增菌液劃線于伊紅美藍(lán)(EMB)平板上，36 ℃培養(yǎng)24 h；隨后挑取綠色、具有金屬光澤的單菌落再次劃線于EMB平板，36 ℃培養(yǎng)24 h；之后選取綠色、帶金屬光澤的單菌落劃線于LB平板，36 ℃培養(yǎng)18～24 h，收集菌體于25%甘油中，-80 ℃條件下保藏備用。

1.2 大腸埃希菌鑒定

將-80 ℃保藏的大腸埃希菌疑似菌株劃線接種于LB平板，36 ℃培養(yǎng)18 h后挑取單菌落，按照VITEK?2 COMPACT 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)儀的標(biāo)準(zhǔn)操作流程鑒定大腸埃希菌。首先使用無菌棉簽在LB平板上刮取適量菌落于0.45%氯化鈉中，調(diào)整濁度至0.50～0.63麥?zhǔn)蠞岫?，然后將菌液放置于充填機(jī)中，通過真空泵以負(fù)壓形式使菌液均勻分布于細(xì)菌鑒定卡片。最后取出細(xì)菌鑒定卡放置于系統(tǒng)培養(yǎng)室，同時(shí)啟動(dòng)相關(guān)程序。分析結(jié)果大概在8～10 h后顯示[11]。細(xì)菌鑒定實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.3 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

使用Biofosun?革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板(Fosun Diagnostics，Shanghai，China)，選擇較常見的16種抗生素。采用美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute of America，CLSI)的M100-S26/M45-A2/M31-A2等文件中推薦的微量肉湯稀釋法測(cè)試具有多重耐藥表型的大腸埃希菌分離株對(duì)氨芐西林(AMP)、奧格門丁(A/C)、慶大霉素(GEN)、大觀霉素(SPT)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異惡唑(SF)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、粘桿菌素(CL)、乙酰甲喹(MEQ)的耐藥能力，參考CLSI(M100-S26/M45-A2/M31-A2)的相關(guān)藥敏折點(diǎn)判定標(biāo)準(zhǔn)將耐藥能力分為耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)。

1.4 基因組DNA的提取

菌株接種至LB瓊脂培養(yǎng)基于36 ℃活化培養(yǎng)18 h，轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基于36 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)4 h，收集菌體。使用上海捷瑞細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒按照說明書步驟提取基因組DNA。

1.5 菌株基因組的測(cè)序、組裝與注釋

基因組DNA提取后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測(cè)序要求后，對(duì)樣品構(gòu)建1個(gè)20 k大片段文庫，使用第三代測(cè)序儀PacBio RS Ⅱ?qū)NA進(jìn)行非擴(kuò)增長片段測(cè)序[12]。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理過濾接頭以及去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后，采用Celera Assembler組裝軟件[13]用OLC組裝算法，調(diào)試參數(shù)進(jìn)行序列組裝，利用quiver對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化[14]。使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline對(duì)基因組進(jìn)行基因預(yù)測(cè)與功能注釋[15]。將測(cè)序得到的全基因組序列及注釋結(jié)果上傳至美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)核酸數(shù)據(jù)庫GenBank上，獲得登錄號(hào)(accession number)分別為CP033635(染色體)、CP033632(pTB-nb1質(zhì)粒)、CP033633(pTB-nb2質(zhì)粒)、CP033634(pTB-nb3質(zhì)粒)、CP033636(pTB-nb4質(zhì)粒)。

1.6 菌株全基因組序列分析

使用PlasmidFinder-1.3(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)[16]鑒定菌株攜帶質(zhì)粒的復(fù)制子類型。使用ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)[17]預(yù)測(cè)菌株染色體基因組及質(zhì)粒中的獲得性耐藥基因。VirulenceFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/)用于鑒定菌株染色體基因組及質(zhì)粒中攜帶的毒力因子[18]。oriTfinder(http://202.120.12.134/oriTfinder/oriTfinder.html)用于預(yù)測(cè)菌株質(zhì)?；蚪M中的水平轉(zhuǎn)移元件[19]。

1.7 S1-PFGE

根據(jù)S1-PFGE的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法[20]，將ECCNB12-2菌株包埋于瓊脂糖凝膠中，使用S1酶進(jìn)行酶切，使用XbaⅠ酶酶切沙門氏菌H9812作為marker，電泳參數(shù)設(shè)置為2.16～63.8 s，電泳時(shí)間為16 h。電泳后膠塊經(jīng)EB染色，脫色后使用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏結(jié)果

細(xì)菌耐藥表型鑒定結(jié)果如表1顯示，ECCNB12-2表現(xiàn)對(duì)氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、頭孢噻夫、恩諾沙星、氧氟沙星這10種抗生素耐藥，僅對(duì)奧格門丁、頭孢他啶、美羅培南及粘桿菌素敏感。

2.2 基因組分析結(jié)果

大腸埃希菌ECCNB12-2的全基因組序列全長5 539 489 bp，GC含量為50.37%，編碼5 742個(gè)蛋白，平均覆蓋深度為122.0×，包含8個(gè)5S rRNA、7個(gè)16S rRNA、7個(gè)23S rRNA和93個(gè)tRNA。此外，ECCNB12-2菌株攜帶有4個(gè)質(zhì)粒。pTB-nb1質(zhì)粒的大小為147 451 bp，復(fù)制子類型為p0111，GC含量為51.38%；pTB-nb2質(zhì)粒的大小為139 752 bp，復(fù)制子類型為IncB/O/K/Z，GC含量為51.62%；pTB-nb3質(zhì)粒的大小為82 252 bp，復(fù)制子類型為IncFⅡ，GC含量為51.44%；pTB-nb4質(zhì)粒的大小為253 793 bp，復(fù)制子類型為IncHI2，GC含量為46.80%。S1-PFGE的結(jié)果與全基因組測(cè)序結(jié)果相符合(圖1)。

2.3 獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)

使用ResFinder工具預(yù)測(cè)ECCNB12-2菌株中可能存在的獲得性耐藥基因。如表2所示，在ECCNB12-2的基因組序列中共檢測(cè)到40個(gè)獲得性耐藥基因。其中，6個(gè)耐藥基因位于染色體基因組上，13個(gè)耐藥基因位于pTB-nb1質(zhì)粒上，21個(gè)耐藥基因位于pTB-nb4質(zhì)粒上，pTB-nb2和pTB-nb3質(zhì)粒上未檢測(cè)到耐藥基因。

表1 ECCNB12-2菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Antibiotic resistance phenotypes of ECCNB12-2

抗生素名稱Antibiotic最小抑菌濃度MIC/(μg·mL-1)抗生素折點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)Breakpoint standard of antibiotic/(μg·mL-1)SIR耐藥結(jié)果Antibiotic resistanceresult (R/I/S)氨芐西林Ampicillin512≤816≥32R奧格門丁Augmentin8/4≤8/416/8≥32/16S慶大霉素Gentamicin128≤48≥16R大觀霉素Spectinomycin>512≤3264≥128R四環(huán)素Tetracycline64≤48≥16R氟苯尼考 Florfenicol256≤48≥16R磺胺異惡唑 Sulfisoxazole512≤256≥512R復(fù)方新諾明Compound sulfamethoxazole>32/608≤2/38≥4/76R頭孢噻呋Ceftiofur>256≤24≥8R頭孢他啶Ceftazidime1≤48≥16S恩諾沙星Enrofloxacin>32≤0.250.5～1≥2R氧氟沙星Ofloxacin64≤24≥8R美羅培南Meropenem≤0.03≤12≥4S安普霉素Apramycin16————粘桿菌素Colistin0.25≤24≥8S乙酰甲喹Maquindox32————

S，I，R分別表示敏感、中介、耐藥。

S， I， R represented susceptible， intermediate， resistant， respectively.

圖1 ECCNB12-2菌株S1-PFGE電泳結(jié)果Fig.1 S1-PFGE result of ECCNB12-2

2.4 毒力因子預(yù)測(cè)

研究使用VirulenceFinder工具分析ECCNB12-2基因組序列中可能存在的毒力因子。如表3所示，ECCNB12-2基因組共有12個(gè)毒力因子被檢出，其中9個(gè)存在于染色體基因組中，2個(gè)存在于pTB-nb2質(zhì)粒上，1個(gè)位于pTB-nb3質(zhì)粒上，pTB-nb1及pTB-nb4質(zhì)粒無毒力因子檢出。結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株中含有多種毒力因子存在，具有對(duì)機(jī)體造成多種毒力作用的潛力。

2.5 水平轉(zhuǎn)移元件

使用oriTfinder工具，預(yù)測(cè)了ECCNB12-2菌株的4個(gè)質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移元件，包括轉(zhuǎn)移區(qū)起點(diǎn)(oriT)，松弛酶，細(xì)菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)基因簇(T4SS)和Ⅳ型偶聯(lián)蛋白(T4CP)基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTB-nb1質(zhì)粒僅含有oriT位點(diǎn)，缺乏松弛酶，T4CP和T4SS；質(zhì)粒pTB-nb2含有oriT位點(diǎn)、松弛酶及T4SS，但缺乏T4CP；質(zhì)粒pTB-nb3含有oriT位點(diǎn)、T4CP與T4SS，但缺乏松弛酶，表明質(zhì)粒pTB-nb1、質(zhì)粒pTB-nb2及質(zhì)粒pTB-nb3具有被誘動(dòng)轉(zhuǎn)移的潛力[21]。預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pTB-nb4質(zhì)粒具有完整的包含oriT位點(diǎn)、松弛酶，T4CP和T4SS的水平轉(zhuǎn)移元件，反映了質(zhì)粒pTB-nb4高度的可自主轉(zhuǎn)移潛力[21]。

表2 ECCNB12-2菌株獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 2 Acquired antimicrobial resistance genes prediction results of ECCNB12-2

獲得性耐藥基因Acquired antimicrobialresistance genes位置Location基因位點(diǎn)Position耐藥表型Antibiotic resistance phenotypeaph(6)-Id染色體Chromosome4520751..4521587氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-Ib染色體Chromosome4521587..4522390氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistancemdf(A)染色體Chromosome3187238..3188470大環(huán)內(nèi)酯類-林可胺類-鏈陽菌素類耐藥Macrolides-Lincosamides-Streptogramins resistancefloR染色體Chromosome4516402..4517615苯丙醇類耐藥Phenicol resistancesul2染色體Chromosome4522451..4523266磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)染色體Chromosome4518216..4519490四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistanceaph(6)-IdpTB-nb13558..4394氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IbpTB-nb14394..5197氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaac(3)-IIdpTB-nb176546..77406氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IIapTB-nb192946..93740氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb1954..1745氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceblaCTX-M-65pTB-nb1103666..104541β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceoqxBpTB-nb195402..98554喹諾酮類耐藥Quinolone resistanceoqxApTB-nb198578..99753喹諾酮類耐藥Quinolone resistancefosA3pTB-nb1108385..108801磷霉素耐藥Fosfomycin resistancemph(A)pTB-nb180498..81403大環(huán)內(nèi)酯類耐藥Macrolide resistancesul2pTB-nb15258..6073磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)pTB-nb1136438..137637四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancedfrA1pTB-nb11838..2311甲氧芐啶耐藥Trimethoprim resistanceaadA22pTB-nb4103983..104774氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb4143960..144751氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA2pTB-nb483152..83943氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaadA1pTB-nb485557..86348氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaac(3)-IVpTB-nb491662..92435氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(4)-IapTB-nb492664..93689氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′)-IapTB-nb497547..98362氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(6)-IdpTB-nb498698..99534氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceaph(3′')-IbpTB-nb499534..100337氨基糖苷類耐藥Aminoglycoside resistanceblaTEM-1BpTB-nb4108376..109236β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceblaOXA-10pTB-nb4143143..143943β-內(nèi)酰胺類耐藥Beta-lactam resistanceqnrS1pTB-nb4137177..137833氟喹諾酮類耐藥Fluoroquinolone resistanceInu(F)pTB-nb4103030..103851林可酰胺類耐藥Lincosamide resistancecmlA1pTB-nb4141619..142878苯丙醇類耐藥Phenicol resistancefloRpTB-nb4148371..149584苯丙醇類耐藥Phenicol resistancecmlA1pTB-nb484205..85464苯丙醇類耐藥Phenicol resistanceARR-2pTB-nb4140846..141298利福霉素耐藥Rifampicin resistancesul3pTB-nb488030..88821磺胺類耐藥Sulphonamide resistancetet(A)pTB-nb4131323..132522四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancetet(A)pTB-nb4146869..147742四環(huán)素類耐藥Tetracycline resistancedfrA14pTB-nb4144826..145299甲氧芐啶耐藥Trimethoprim resistance

3 討論

細(xì)菌耐藥性問題是目前存在的非常嚴(yán)重的公共安全問題，已經(jīng)不斷有從臨床、食品和環(huán)境中分離到多重耐藥大腸埃希菌的報(bào)道。本研究從寧波市市售雞肉樣品中分離到一株大腸埃希菌，藥敏結(jié)果顯示，其對(duì)氨芐西林、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、頭孢噻夫、恩諾沙星、氧氟沙星這10種藥物耐藥，確定其為一株具有較強(qiáng)危害性的多重耐藥大腸埃希菌。

表3 ECCNB12-2菌株毒力因子預(yù)測(cè)結(jié)果

Table 3 Virulence factors prediction results of ECCNB12-2

毒力因子Virulence factor位置Location基因位點(diǎn)Position蛋白功能Protein functionair染色體Chromosome5140659..5149460腸聚集性免疫球蛋白重復(fù)蛋白Enteroaggregative immunoglobulin repeat proteinastA染色體Chromosome5210002..5210118EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastA染色體Chromosome4255711..4255827EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxineilA染色體Chromosome5149512..5151209門氏菌同系物Salmonella HilA homologgad染色體Chromosome2289917..2291317谷氨酸脫羧酶Glutamate decarboxylasegad染色體Chromosome5433270..5434670谷氨酸脫羧酶Glutamate decarboxylaseiha染色體Chromosome2580237..2582324粘附蛋白Adherence proteiniss染色體Chromosome2794043..2794351提高血清存活率Increased serum survivallpfA染色體Chromosome5062316..5062888長極性菌毛Long polar fimbriaeastApTB-nb269664..69780EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastApTB-nb260775..60891EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxinastApTB-nb322596..22712EAST-1熱穩(wěn)定毒素EAST-1 heat-stable toxin

雞肉是多重耐藥菌株的重要載體。只帥等[22]研究表明，雞肉源大腸埃希菌中，多重耐藥大腸埃希菌的分離率高達(dá)92.1%，高于豬肉源的75.3%，羊肉源的67.8%以及牛肉源的52.2%。同時(shí)，雞肉源高風(fēng)險(xiǎn)多重耐藥菌株的占比相較其他肉類也較大，11重及以上耐藥菌株全部來自于雞肉樣品。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了雞肉食品中細(xì)菌耐藥問題的嚴(yán)重性，相關(guān)結(jié)果將為雞肉食品的安全評(píng)估提供參考數(shù)據(jù)。

獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ECCNB12-2菌株攜帶的獲得性耐藥基因高達(dá)40個(gè)，與藥敏實(shí)驗(yàn)得到的ECCNB12-2菌株的耐藥表型具有一定對(duì)應(yīng)性，例如aph(6)-Id、aph(3′')-Ib、aac(3)-IId等多個(gè)可導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥表型的耐藥基因的存在可能是介導(dǎo)菌株表現(xiàn)對(duì)慶大霉素和大觀霉素耐藥的主要原因；sul2、sul3等耐藥基因的存在可能是導(dǎo)致菌株表現(xiàn)磺胺異惡唑耐藥表型的主要原因。此外，獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示ECCNB12-2可能具有除監(jiān)測(cè)抗生素之外的耐藥表型，例如菌株攜帶的ARR-2耐藥基因的表達(dá)可能導(dǎo)致對(duì)利福霉素的耐藥性、fosA3耐藥基因可能導(dǎo)致菌株表現(xiàn)磷霉素耐藥表型。這些結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株可能具有更廣譜的耐藥表型存在，表明了雞肉樣品中細(xì)菌耐藥問題的嚴(yán)重性。

ECCNB12-2菌株攜帶有多個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)的耐藥基因例如blaCTX-M-65、blaTEM-1B。blaCTX-M-65與blaTEM-1B基因會(huì)導(dǎo)致菌株獲得超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥表型。近年來，超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥問題十分嚴(yán)重，已呈全球流行趨勢(shì)[23-24]。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象ECCNB12-2菌株同時(shí)攜帶有兩個(gè)導(dǎo)致超廣譜β-內(nèi)酰胺類耐藥表型的耐藥基因，可能加重該耐藥表型的嚴(yán)重性。

菌株質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移元件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，所有質(zhì)粒都具有轉(zhuǎn)移至其他菌株的能力，其中pTB-nb4質(zhì)粒攜帶有完整的水平轉(zhuǎn)移元件，具有高度的自主轉(zhuǎn)移潛力。同時(shí)獲得性耐藥基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明pTB-nb1質(zhì)粒和pTB-nb4質(zhì)粒是耐藥基因的主要攜帶質(zhì)粒，特別是屬于IncHI2類型的pTB-nb4質(zhì)粒，共攜帶有21個(gè)耐藥基因。IncHI2型質(zhì)粒是主要的流行性質(zhì)粒之一，在腸桿菌科中非常常見，具有較高的接合轉(zhuǎn)移效率。同時(shí)相關(guān)研究報(bào)道IncHI2型質(zhì)粒與多重耐藥表型具有一定的相關(guān)關(guān)系，也是攜帶blaNDM-1、mcr-1等高風(fēng)險(xiǎn)耐藥基因的主要質(zhì)粒類型之一[25-27]。因此，pTB-nb4質(zhì)粒攜帶的耐藥基因具有隨著pTB-nb4質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移而發(fā)生廣泛水平傳播的潛力，并可能同時(shí)隨著雞肉的產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)生廣泛垂直傳播，嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生健康。

病原性大腸埃希菌會(huì)通過毒力因子作用引起局部或全身感染性疾病，對(duì)畜禽養(yǎng)殖及人類健康帶來了嚴(yán)重的危害，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[28]。毒力因子預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ECCNB12-2菌株攜帶有多個(gè)毒力因子，說明該菌株具有潛在的毒力能力。例如，ECCNB12-2菌株攜帶的iss毒力因子被證明與大腸埃希菌的毒力密切相關(guān)，iss基因可以增強(qiáng)大腸埃希菌的血清抵抗力，使菌株在宿主體內(nèi)迅速增殖[29]。同時(shí)，ECCNB12-2菌株自身的多重耐藥性增加了其本身對(duì)不利環(huán)境的耐受性。因此，ECCNB12-2菌株具有較高的傳播風(fēng)險(xiǎn)性。