連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育團(tuán)頭魴的遺傳多樣性分析和RAPD鑒別方法的建立

唐首杰，畢 詳，張飛明，張友良

(1.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306； 4.上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場(chǎng)，上海 201616)

人工雌核發(fā)育是一種有效的產(chǎn)生純系的手段，而且在魚類染色體操作、遺傳分析以及性別控制等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。迄今為止，各國(guó)學(xué)者已先后在鯉科、鮭科、鰈科、鰍科和鯛科等近百種重要經(jīng)濟(jì)魚類開展雌核發(fā)育研究并獲得成功[1-8]，在一些重要水生模式動(dòng)物如青鳉和斑馬魚等也有諸多成功報(bào)道[9-10]。

團(tuán)頭魴浦江1號(hào)是養(yǎng)殖性能優(yōu)良的草食性魚類首例選育良種[11]，為使該良種的優(yōu)良性狀基因進(jìn)一步純化、鞏固和發(fā)展，自1999年以來(lái)，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源研究室先后對(duì)團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F5和F6進(jìn)行了人工雌核發(fā)育(抑制第二次成熟分裂)的研究，成功地生產(chǎn)了一定數(shù)量的雌核發(fā)育魚(G1)[12]；隨后，他們又通過(guò)抑制一次雌核發(fā)育魚(G1)卵子的第二次成熟分裂成功地誘導(dǎo)出兩次雌核發(fā)育魚(G2)[13]，在G2的基礎(chǔ)上，用同樣的方法誘導(dǎo)得到連續(xù)3次減數(shù)分裂雌核發(fā)育魚(G3)。近幾年的養(yǎng)殖實(shí)踐證明，這些雌核發(fā)育團(tuán)頭魴(G1、G2、G3)及其后代具有很好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，其生長(zhǎng)速度超過(guò)了團(tuán)頭魴選育系。但在實(shí)際的育種過(guò)程中，不同雌核發(fā)育世代團(tuán)頭魴群體的遺傳純合度的具體指標(biāo)如何，是否能達(dá)到遺傳育種和遺傳分析所需要的純合度？此外，在雌核發(fā)育過(guò)程中可能由于經(jīng)過(guò)輻射處理的異源精子的某些未失活遺傳物質(zhì)、物理隔離的不完善等因素而影響雌核發(fā)育魚群體的遺傳純合性。因此，在將培育的雌核發(fā)育群體應(yīng)用于育種實(shí)踐前，需要用各種技術(shù)在分子水平上對(duì)其基因組進(jìn)行精確的遺傳學(xué)分析，以確定雌核發(fā)育類型魚類群體的遺傳純合度是否能達(dá)到遺傳育種的要求。另外，由于雌核發(fā)育團(tuán)頭魴在形態(tài)上和普通團(tuán)頭魴完全一致，從外形上無(wú)法鑒別普通團(tuán)頭魴與雌核發(fā)育團(tuán)頭魴(G1、G2、G3)，這導(dǎo)致這幾種魚(團(tuán)頭魴浦江1號(hào)、G1、G2、G3)在養(yǎng)殖生產(chǎn)和選育過(guò)程中極易混雜，為下一步的純系選育工作埋下了隱患。鑒于此，采用分子遺傳標(biāo)記技術(shù)分析不同雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性和遺傳純合度，進(jìn)而尋找能夠有效區(qū)分不同團(tuán)頭魴群體(團(tuán)頭魴浦江1號(hào)、G1、G2、G3)的特異性分子標(biāo)記已成為迫切需要解決的問(wèn)題。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)是建立在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)基礎(chǔ)上的多位點(diǎn)DNA指紋技術(shù)，具有靈敏、快捷、簡(jiǎn)便、費(fèi)用少等特點(diǎn)。該技術(shù)自1990年被提出以來(lái)[14-15]，已被廣泛應(yīng)用于魚類育種群體的遺傳多樣性分析[16]和品系鑒別[17]。賈海波等[18]采用RAPD技術(shù)分析了兩個(gè)人工雌核發(fā)育紅白錦鯉(Cyprinuscarpio)群體的遺傳多樣性。陳金輝等[19]采用RAPD技術(shù)評(píng)估了兩個(gè)不同人工雌核發(fā)育草魚(Ctenopharyngodonidellus)群體的遺傳多樣性和遺傳純合度。張桂蓉等[20]采用RAPD技術(shù)分析了兩個(gè)人工雌核發(fā)育系鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)近交F1群體的遺傳多樣性，驗(yàn)證了雌核發(fā)育系后代的遺傳穩(wěn)定性。在魚類遺傳育種實(shí)踐中，RAPD技術(shù)已成為育種群體鑒別的快速有效標(biāo)記之一。鄒曙明等[12]通過(guò)RAPD分析發(fā)現(xiàn)了團(tuán)頭魴選育系群體和雌核發(fā)育群體各自的特征性條帶。賈海波等[18]采用RAPD方法找到了7個(gè)引物的擴(kuò)增譜帶可以作為區(qū)分兩個(gè)不同雌核發(fā)育錦鯉群體間的遺傳標(biāo)記。陳金輝等[19]采用RAPD技術(shù)找到了連續(xù)兩代人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚群體和一代人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚群體間的特異性分子標(biāo)記。司偉等[21]運(yùn)用RAPD技術(shù)成功鑒別了建鯉雌核發(fā)育后代。

為評(píng)估不同雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體(G1、G2、G3)的遺傳多樣性和遺傳純合度，鑒別不同團(tuán)頭魴群體(團(tuán)頭魴浦江1號(hào)、G1、G2、G3)，本研究以普通團(tuán)頭魴(團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F9)群體作為對(duì)照，利用RAPD技術(shù)對(duì)連續(xù)三代人工雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體(G1、G2、G3)進(jìn)行基因組掃描，目標(biāo)有二，其一，確定不同雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性和遺傳純合度，進(jìn)而從分子水平評(píng)估連續(xù)多代人工減數(shù)分裂雌核發(fā)育的效果；其二，尋找區(qū)分不同團(tuán)頭魴育種群體(團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F9、G1、G2、G3)的穩(wěn)定的分子遺傳標(biāo)記，建立團(tuán)頭魴雌核發(fā)育群體的分子鑒別技術(shù)，為團(tuán)頭魴雌核發(fā)育純系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

對(duì)照組團(tuán)頭魴選育系群體樣本為浦江1號(hào)選育系F9群體，試驗(yàn)組為團(tuán)頭魴一代雌核發(fā)育群體(G1)、團(tuán)頭魴連續(xù)兩代雌核發(fā)育群體(G2)和團(tuán)頭魴連續(xù)三代雌核發(fā)育群體(G3)，每群體各采集35尾，每尾剪取少許鰭條于95%乙醇中保存?zhèn)溆?，所有樣本均采自上海海洋大學(xué)魚類種質(zhì)研究試驗(yàn)站(上海市浦東新區(qū)新場(chǎng)鎮(zhèn))。RAPD隨機(jī)引物為10堿基引物，引物序號(hào)為S1～S100[編號(hào)同生工生物工程(上海)股份有限公司引物目錄]，共100個(gè)，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取

基因組DNA提取采用常規(guī)的酚-氯仿方法進(jìn)行[22]。

1.2.2 基因組DNA的RAPD分析

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR儀上進(jìn)行，每一樣品的反應(yīng)總體積25 μL，含2.5 μL 10×擴(kuò)增緩沖液，其中含100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 9.0)，500 mmol·L-1KCl，15 mmol·L-1MgCl2，1% (質(zhì)量濃度)明膠，1%(體積分?jǐn)?shù))Triton X-100，最后調(diào)節(jié)pH值至8.0。2 μL dNTP混合液(每種dNTP的終濃度 0.2 mmol·L-1)，引物2 μL(終濃度0.2 μmol·L-1)，2 μL基因組DNA(50～150 ng)，0.5 μLTaqDNA聚合酶(1.25單位)，16 μL無(wú)菌重蒸水，最后加入30 μL石臘油。

PCR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，接下來(lái)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃ 45 s，36 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s；最后一次循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸5min。

取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓為5 V·cm-1，采用的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為MarkerⅢ[天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品]。電泳結(jié)束后，電泳凝膠經(jīng)溴化乙錠染色，用Syngene凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描攝像，并用GeneTools軟件對(duì)每個(gè)RAPD隨機(jī)引物擴(kuò)增條帶的分子質(zhì)量進(jìn)行估算。每個(gè)RAPD隨機(jī)引物至少被重?cái)U(kuò)一次以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理與分析

首先對(duì)照擴(kuò)增圖譜分別統(tǒng)計(jì)RAPD特異性條帶在群體間的出現(xiàn)頻率。再進(jìn)行遺傳多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅記錄清晰且重復(fù)性好的DNA條帶。根據(jù)MarkerⅢ各帶的遷移率確定擴(kuò)增產(chǎn)物各帶的遷移率，同一引物對(duì)不同個(gè)體擴(kuò)增出的RAPD條帶，只要遷移率相同都視為同一類型(性狀)記為1，缺乏此帶的記為0；以此類推，將所有個(gè)體的RAPD條帶轉(zhuǎn)換成二元數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGENE1.31軟件包[23]計(jì)算以下遺傳變異參數(shù)：

多態(tài)位點(diǎn)比例(P)：P=(多態(tài)位點(diǎn)數(shù)/位點(diǎn)總數(shù))×100%。

(1)

(2)

式(2)中：pi為某一座位上第i個(gè)等位基因在某一群體中出現(xiàn)的頻率；lnpi為pi的自然對(duì)數(shù)；r為等位基因數(shù)目。

群體內(nèi)個(gè)體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Ds)和Nei’s遺傳相似系數(shù)(I)按照Nei[25]的方法計(jì)算：

Ds=-lnI；

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

式(3)～(7)中，Xij、Yij分別為個(gè)體X、Y第j座位第i個(gè)等位基因頻率；r為基因座數(shù)目；m為等位基因數(shù)目。

群體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Ds)和Nei’s遺傳相似系數(shù)(I)按照Nei[25]的方法計(jì)算：

Ds=-lnI；

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

式(8)～(12)中：Xij、Yij分別為群體X、Y第j座位第i個(gè)等位基因頻率；r為群體中的基因座數(shù)目；m為等位基因數(shù)目。

用Arlequin 3.01軟件[26]估測(cè)群體間成對(duì)FST值[27]，并利用置換檢驗(yàn)法(permutation test)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(重復(fù)次數(shù)為1 000)。

采用分子方差分析(analysis of molecular variance，AMOVA)估算各群體間和群體內(nèi)的遺傳變異及分化水平。通過(guò)3種分子遺傳變量進(jìn)行分析：FST為群體內(nèi)個(gè)體之間(among individuals within populations)的遺傳變異；FSC為組內(nèi)各群體間(among populations within groups)的變異程度；FCT為不同組別之間(among groups)的遺傳變異程度。并用置換檢驗(yàn)法(permutation test)進(jìn)行1 000次重復(fù)模擬計(jì)算，以上運(yùn)算在Arlequin 3.01軟件[26]中完成。

利用MEGA 4.0軟件包[28]根據(jù)群體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(DS)，用UPGMA法(unweighted pair group method with arithmetic means)和NJ法(neighbour-joining method)構(gòu)建群體間聚類圖。

采用LSD-t檢驗(yàn)比較群體間遺傳多樣性參數(shù)(多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon信息指數(shù))，Bonferroni校正P值[29]，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為α=0.05，在SPSS 19.0 軟件上完成運(yùn)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD擴(kuò)增結(jié)果

本研究從100條隨機(jī)引物中篩選出39條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性好、擴(kuò)增效果穩(wěn)定的隨機(jī)引物(表1)，并對(duì)清晰可計(jì)數(shù)位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各引物所產(chǎn)生的條帶數(shù)見表2。單條引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為2～10條，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度集中在200～2 000 bp。39條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴(kuò)增條帶總數(shù)分別為213條、202條、200條和190條，呈現(xiàn)出隨雌核發(fā)育世代數(shù)增加而減少的趨勢(shì)。單條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴(kuò)增條帶數(shù)的范圍分別為2～10、2～9、2～9和2～10。

2.2 群體內(nèi)遺傳變異分析

2.2.1 多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon信息指數(shù)

39條引物在F9、G1、G2和G3群體中的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon信息指數(shù)見表2。39條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴(kuò)增到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)分別為77、72、54和51，單條引物在F9、G1、G2和G3群體中擴(kuò)增到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)范圍分別為0～7、0～4、0～5和0～7。F9、G1、G2和G3群體的多態(tài)位點(diǎn)比例分別為36.15%、35.64%、27.00%和26.84%，F(xiàn)9群體的多態(tài)位點(diǎn)比例最高，G3群體的多態(tài)位點(diǎn)比例最低，3個(gè)雌核發(fā)育群體的多態(tài)位點(diǎn)比例均明顯低于對(duì)照組F9群體；隨著雌核發(fā)育世代數(shù)的增加，多態(tài)位點(diǎn)比例呈現(xiàn)逐代降低的趨勢(shì)，即G1>G2>G3。F9、G1、G2和G3群體的Shannon信息指數(shù)為0.138 3～0.207 9，F(xiàn)9群體的Shannon信息指數(shù)最高，G3群體的Shannon信息指數(shù)最低，3個(gè)雌核發(fā)育群體的Shannon信息指數(shù)均明顯低于對(duì)照組F9群體；Shannon信息指數(shù)隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而降低，即：G1>G2>G3。

群體間多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon信息指數(shù)的LSD-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示(表3)，在α=0.05顯著性水平上，群體間多態(tài)位點(diǎn)比例差異不顯著(P=0.261～1.000)，群體間Shannon信息指數(shù)差異不顯著(P=0.312～1.000)。

總體而言，3個(gè)雌核發(fā)育群體的遺傳多樣性水平均明顯低于對(duì)照組F9群體，隨著雌核發(fā)育世代數(shù)的增加，遺傳多樣性水平呈現(xiàn)逐代降低的趨勢(shì)，即G1>G2>G3。

表1 本研究使用的39條RAPD引物序列及編號(hào)

Table 1 Sequences and codes of 39 random primers used in the study

引物編號(hào)Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)引物編號(hào)Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)引物編號(hào)Primer code序列(5′-3′)Sequence(5′-3′)S1GTTTCGCTCCS29GGGTAACGCCS66GAACGGACTCS2TGATCCCTGGS30GTGATCGCAGS67GTCCCGACGAS3CATCCCCCTGS32TCGGCGATAGS68TGGACCGGTGS4GGACTGGAGTS33CAGCACCCACS69CTCACCGTCCS7GGTGACGCAGS38AGGTGACCGTS70AGGGCCGTCTS10CTGCTGGGACS40GTTGCGATCCS71AAAGCTGCGGS17AGGGAACGAGS45TGAGCGGACAS72TGTCATCCCCS19ACCCCCGAAGS50GGTCTACACCS73AAGCCTCGTCS21CAGGCCCTTCS51AGCGCCATTGS74GGATGAGACCS22TGCCGAGCTGS56AGGGCGTAAGS75GACGGATCAGS24AATCGGGCTGS58GAGAGCCAACS76CACACTCCAGS25AGGGGTCTTGS60ACCCGGTCACS77TTCCCCCCAGS28GTGACGTAGGS64CCGCATCTACS78TGAGTGGGTG

表2 四個(gè)群體的擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和Shannon信息指數(shù)(S)

Table 2 The number of amplified bands， polymorphic loci and Shannon’s information index (S) within four populations

引物Primer擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)(多態(tài)位點(diǎn)數(shù))Number of amplified bands (polymorphic loci)F9G1G2G3Shannon信息指數(shù)(S)Shannons information index (S)F9G1G2G3S15(2)5(1)5(2)4(1)0.16400.24930.18550.1289S24(3)3(0)3(0)3(0)0.00000.39760.00000.0000S36(1)4(1)4(1)4(0)0.09870.03780.09470.0000S44(1)4(1)4(3)4(2)0.16580.16580.49270.3116S74(1)4(2)4(1)3(0)0.17380.10780.13890.0000S105(2)5(1)6(3)4(0)0.13670.20780.33000.0000S177(1)7(3)7(0)7(0)0.37490.09470.00000.0000S193(0)2(1)2(0)2(0)0.34540.00000.00000.0000S215(0)5(0)6(1)6(3)0.00000.00000.11510.3229S225(0)5(2)5(0)5(0)0.25780.00000.00000.0000S2410(7)9(4)9(4)10(7)0.31570.40120.24110.4266S258(7)4(0)4(0)4(0)0.00000.40170.00000.0000S288(6)7(2)5(0)5(2)0.14660.36980.00000.1558S296(2)6(3)6(0)4(0)0.26660.20000.00000.0000S307(6)6(3)6(1)7(3)0.39470.50320.07940.2508S326(6)8(4)3(0)4(1)0.36270.43520.00000.1159S335(3)5(0)5(4)5(2)0.00000.41450.53050.2652S384(0)5(0)6(5)4(0)0.00000.00000.48610.0000S405(2)5(4)5(3)5(2)0.44110.21510.40340.3292S455(2)5(2)5(0)5(1)0.24000.26710.00000.1326S502(2)2(2)3(2)3(3)0.45130.45130.40630.6211S518(0)8(4)8(1)8(0)0.30470.00000.08290.0000S564(0)4(3)4(0)4(0)0.49500.00000.00000.0000S584(1)4(0)4(1)3(0)0.00000.16580.17270.0000S606(3)5(3)5(1)7(6)0.26620.22720.03780.4491S647(2)6(2)7(2)7(3)0.16580.13680.11590.2440S666(0)7(3)7(4)5(0)0.28740.00000.34040.0000S677(3)6(4)7(3)7(3)0.38420.23510.25500.2828S684(1)4(2)4(1)3(0)0.16400.05290.05290.0000S695(2)5(1)5(2)4(0)0.13910.27630.26710.0000S706(0)6(1)6(0)6(4)0.20000.00000.00000.4421S716(3)6(4)5(2)6(2)0.29510.31370.14370.2257S724(2)4(2)3(1)3(1)0.31160.31160.16110.1078S734(1)4(1)3(0)3(0)0.06610.17270.00000.0000S747(2)6(0)7(1)7(2)0.00000.19080.09210.1603S757(3)7(2)7(3)4(0)0.15360.23820.24840.0000S764(0)4(0)4(0)4(1)0.00000.00000.00000.1727S775(0)5(2)5(1)5(1)0.35330.00000.13260.1326S785(0)5(2)6(1)6(1)0.18520.00000.09260.1151 總計(jì)Total213(77)202(72)200(54)190(51) P/%36.1535.6427.0026.84 平均Mean0.20790.18570.14610.1383

2.2.2 群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

F9、G1、G2和G3群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表4。4個(gè)群體的群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)為0.828 5～0.906 0，G3群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)最高(0.906 0)，F(xiàn)9群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)最低(0.828 5)，3個(gè)雌核發(fā)育群體的群體內(nèi)個(gè)體間平均遺傳相似系數(shù)均明顯高于對(duì)照組F9群體；群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)呈現(xiàn)隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而升高的趨勢(shì)，即G3>G2>G1。

表3 四個(gè)團(tuán)頭魴群體間多態(tài)位點(diǎn)比例(對(duì)角線上)和Shannon信息指數(shù)(對(duì)角線下)LSD-t檢驗(yàn)P值

Table 3P-values of LSD-ttests from percentage of polymorphic loci (above diagonal) and Shannon’s information index (below diagonal) between four populations ofM.amblycephala

群體PopulationF9G1G2G3F91.0000.9640.402G11.0000.6690.261G20.5061.0001.000G30.3121.0001.000

4個(gè)群體的群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離為0.099 1～0.190 8，G3群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離最低(0.099 1)，F(xiàn)9群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離最高(0.190 8)，3個(gè)雌核發(fā)育群體的群體內(nèi)個(gè)體間平均遺傳距離均明顯低于對(duì)照組F9群體；群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳距離呈現(xiàn)隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而降低的趨勢(shì)，即G1>G2>G3。

總體而言，3個(gè)雌核發(fā)育群體的遺傳純度(遺傳相似系數(shù))均明顯高于對(duì)照組F9群體，隨著雌核發(fā)育世代數(shù)的增加，雌發(fā)育群體內(nèi)的遺傳純度呈逐代上升的趨勢(shì)，即G3>G2>G1。

2.3 群體間遺傳變異分析

2.3.1 群體間RAPD特異片段分析

在39條擴(kuò)增穩(wěn)定、多態(tài)性豐富的隨機(jī)引物中，有5條引物在群體間產(chǎn)生了特異性DNA片段，這5條引物分別是S3、S40、S58、S71和S75(表5)。其中，引物S3擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約136 bp片段，該片段在G3群體中出現(xiàn)頻率達(dá)100%，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率均為0(圖1)；同時(shí)，引物S3擴(kuò)增出另一條長(zhǎng)約797 bp片段，該片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率均為100%(圖1)。由此可見，引物S3產(chǎn)生的RAPD圖譜及其特異片段(136 bp和797 bp)可以作為區(qū)分G3群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標(biāo)記。

如圖2所示，引物S40擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約780 bp片段，該片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為100%，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率僅為5.71%～14.29%，筆者認(rèn)為，該片段在G3群體中的高出現(xiàn)頻率可作為區(qū)分G3群體與其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)的重要依據(jù)。

如圖3所示，引物S58擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約439 bp片段，該片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)71.43%～100%，由此可以認(rèn)為，引物S58產(chǎn)生的RAPD特異片段(439 bp)可作為區(qū)分G3群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標(biāo)記。

如圖4所示，引物S71擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約504 bp片段，該片段在G2群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G3)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)71.43%～85.71%，因此，引物S71產(chǎn)生的RAPD特異片段(504 bp)可作為區(qū)分G2群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G3)的分子遺傳標(biāo)記。

如圖5所示，引物S75擴(kuò)增出一條長(zhǎng)約313 bp片段，該片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)85.71%～100%，鑒于此，引物S75產(chǎn)生的RAPD特異片段(313 bp)可作為區(qū)分G3群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)的分子遺傳標(biāo)記。

綜上所述，4條隨機(jī)引物(S3、S40、S58和S75)可用于區(qū)分G3群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)，其中，使用引物S3進(jìn)行群體鑒別的可靠性最高。僅1條隨機(jī)引物(S71)能用于區(qū)分G2群體和其他3個(gè)群體(F9、G1和G3)。此外，目前尚未找到能有效區(qū)分F9群體和G1群體的隨機(jī)引物。

2.3.2 群體間遺傳相似系數(shù)、遺傳距離和遺傳分化

表4 群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離

Table 4 Genetic identity and genetic distance between individuals within each population

數(shù)值Value遺傳相似系數(shù)Genetic identityF9G1G2G3遺傳距離Genetic distanceF9G1G2G3平均值Mean0.82850.85380.89680.90600.19080.15880.10930.0991最大值Maximum0.91150.92040.93810.94250.36430.22760.15270.1527最小值Minimum0.69470.79650.85840.85840.09270.08300.06390.0592

表5 五個(gè)引物在4個(gè)群體間擴(kuò)增出的特異DNA片段及其出現(xiàn)頻率

Table 5 Size and frequencies of specific DNA fragments amplified by 5 random primers among four populations

引物Primer特異片段大小Specific fragment size/bp出現(xiàn)頻次(比率,%) Frequency (Percentage, %)F9G1G2G3S31360/35 (0)0/35 (0)0/35 (0)35/35 (100%)S379735/35(100%)35/35(100%)35/35(100%)0/35 (0)S407802/35 (5.71%)3/35 (8.57%)5/35 (14.29%)35/35 (100%)S5843930/35 (85.71%)35/35 (100%)25/35 (71.43%)0/35 (0)S7150430/35 (85.71%)25/35 (71.43%)0/35 (0)30/35 (85.71%)S7531335/35 (100%)35/35 (100%)30/35 (85.71%)0/35 (0)

M，MarkerⅢ；箭頭示特異DNA片段。下同。M， MarkerⅢ; The arrows showed the specific DNA fragment. The same as below.圖1 引物S3在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜Fig.1 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S3

圖2 引物S40在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜Fig.2 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S40

4個(gè)群體間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離見表6。群體間遺傳相似系數(shù)為0.840 4～0.920 4，G1群體和G3群體間遺傳相似系數(shù)最低(0.840 4)，F(xiàn)9群體和G2群體間遺傳相似系數(shù)最高(0.920 4)。群體間遺傳距離為0.082 9～0.173 9，F(xiàn)9群體和G2群體間遺傳距離最小(0.082 9)，G1群體和G3群體間遺傳距離最大(0.173 9)。

4個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)(成對(duì)FST值)見表7。群體間成對(duì)FST值為0.269 2～0.419 5，F(xiàn)9群體和G2群體間FST值最小(0.269 2)，G2群體和G3群體間FST值最大(0.419 5)。經(jīng)1 000次置換檢驗(yàn)得到的FST值的P值為0.000 0～0.009 0，均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，據(jù)此可推測(cè)，4個(gè)群體間存在極顯著的遺傳分化。

2.3.3 分子方差分析

本研究對(duì)4個(gè)團(tuán)頭魴群體進(jìn)行分組(1個(gè)組、2個(gè)組、3個(gè)組)，從不同角度對(duì)群體遺傳變異進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)。結(jié)果顯示(表8)，在任何一種分組條件下，F(xiàn)ST值都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，說(shuō)明群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳分化極顯著。當(dāng)把所有群體分成2個(gè)組或3個(gè)組時(shí)，F(xiàn)SC值均達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，表明群體間存在極顯著的遺傳分化。這證實(shí)了群體間遺傳分化指數(shù)(FST值)的分析結(jié)果。當(dāng)把所有群體分成2個(gè)組或3個(gè)組時(shí)，在任何一種分組條件下，F(xiàn)CT值均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)，表明組別之間不存在顯著的遺傳分化。

圖3 引物S58在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜Fig.3 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S58

圖4 引物S71在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜Fig.4 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S71

圖5 引物S75在4個(gè)群體中的擴(kuò)增圖譜Fig.5 Electrophoretogram of RAPD products obtained from primer S75

2.3.4 聚類分析

基于群體間Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離構(gòu)建的4個(gè)團(tuán)頭魴群體間NJ聚類圖和UPGMA聚類圖如圖6所示。因聚類方法的差異，2種聚類圖顯示了各自的特點(diǎn)，很難說(shuō)哪種聚類圖最能反映真實(shí)的群體間遺傳關(guān)系。但2種聚類圖(圖6-a、b)均顯示，F(xiàn)9、G2和G3群體可被聚為一類，G1群體和其他3個(gè)群體(F9、G2、G3)間聚類關(guān)系較遠(yuǎn)，這也驗(yàn)證了前文中群體間遺傳距離的結(jié)果。

表6 四個(gè)群體間的遺傳相似系數(shù)(對(duì)角線上)和遺傳距離(對(duì)角線下)

Table 6 Genetic similarity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) between populations

群體PopulationF9G1G2G3F90.85820.92040.8920G10.15290.87490.8404G20.08290.13360.9037G30.11430.17390.1012

表7 四個(gè)群體間的遺傳分化指數(shù)(成對(duì)FST值)(對(duì)角線上)及其P值(對(duì)角線下)

Table 7 Genetic differentiation index (PairwiseFSTvalues) (above diagonal) and the probabilities of the test of genetic differentiation (below diagonal) between four populations

群體PopulationF9G1G2G3F90.28860.26920.3661G100.32850.4062G2000.4195G300.00900

表8 四個(gè)團(tuán)頭魴群體間遺傳差異的分子方差分析(AMOVA)

Table 8 Analysis of molecular variance (AMOVA) among four populations ofM.amblycephala

分組Grouping變異百分率Percentage of variation/%群體內(nèi)Withinpopulations組內(nèi)群體間Among populationswithin groups組間Amonggroups固定指數(shù)Fixation indexFSTFSCFCT未分組One group65.2834.720.3472??2個(gè)組Two groups(1.F9;2.G1,G2,G3)67.8239.98-7.800.3218??0.3708??-0.0780ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G1;2.G2,G3)65.1734.350.480.3483??0.3451??0.0048ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G2;2.G1,G3)65.3835.10-0.480.3462??0.3493??-0.0048ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G3;2.G1,G2)65.2834.720.000.3472??0.3472??0.0000ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G1,G2;2.G3)62.3128.609.090.3769??0.3146??0.0909ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G1,G3;2.G2)68.7641.91-10.680.3124??0.3787??-0.1068ns2個(gè)組Two groups(1.F9,G2,G3;2.G1)62.7329.477.800.3727??0.3196??0.0780ns3個(gè)組Three groups(1.F9;2.G1;3.G2,G3)65.1833.890.930.3482??0.3421??0.0093ns3個(gè)組Three groups(1.F9;2.G1,G2;3.G3)65.0833.111.810.3492??0.3372??0.0181ns3個(gè)組Three groups(1.F9;2.G1,G3;3.G2)67.1049.62-16.720.3290??0.4251??-0.1672ns3個(gè)組Three groups(1.F9,G1;2.G2;3.G3)65.3034.87-0.160.3470??0.3481??-0.0017ns3個(gè)組Three groups(1.F9,G2;2.G1;3.G3)63.6321.2615.100.3637??0.2504??0.1510ns3個(gè)組Three groups(1.F9,G3;2.G1;3.G2)65.4836.34-1.820.3452??0.3569??-0.0182ns

*表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示“無(wú)顯著性”(P>0.05)。

* denotedP<0.05，**denotedP<0.01，ns denoted non-significant(P>0.05).

圖6 基于群體間遺傳距離的4個(gè)團(tuán)頭魴群體間NJ聚類圖(a)和UPGMA聚類圖(b)Fig.6 NJ (a) and UPGMA (b) dendrogram of four populations of M. amblycephala based on genetic distances

3 討論

3.1 連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育效果分析

在傳統(tǒng)的育種方法中，建立一個(gè)遺傳純系或選育系一般需要通過(guò)連續(xù)數(shù)代的近親交配來(lái)完成。同時(shí)還會(huì)因近交衰退及繁育條件限制對(duì)部分個(gè)體的淘汰造成育種材料的丟失，因而這是一項(xiàng)長(zhǎng)期、大量而嚴(yán)密的工作[30]。而采用人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的方法可大大地加速純化過(guò)程。人工誘導(dǎo)魚類雌核發(fā)育的方式有兩種：一種是通過(guò)抑制第二極體釋放來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，稱為減數(shù)分裂雌核發(fā)育；另一種是通過(guò)抑制第一次卵裂來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，稱為卵裂雌核發(fā)育[30]。一次卵裂雌核發(fā)育相當(dāng)于8～10代同胞兄妹交配，一次卵裂雌核發(fā)育加一次減數(shù)分裂雌核發(fā)育就可以獲得純系[10]。據(jù)吳清江等[1]報(bào)道，鯉(CyprinuscarpioL.)雌核發(fā)育第一代近交系數(shù)已接近60%，2～3代雌核發(fā)育可取代鯉8～10代近交。

理論上，抑制第二極體釋放誘導(dǎo)雌核發(fā)育二倍體時(shí)，如果不發(fā)生重組，子代都應(yīng)成為完全的純合體，但由于魚類的染色體一般都發(fā)生一次交叉，因此距離著絲粒近的基因位點(diǎn)為純合體，距離著絲粒遠(yuǎn)的基因位點(diǎn)，雜合體的比率根據(jù)基因位點(diǎn)在染色體上的位置而變化，范圍為0～1.0。在實(shí)際的雌核發(fā)育育種實(shí)踐中，連續(xù)多代誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育，將快速地提高遺傳相似系數(shù)。雖然是雜合子，但是親本的遺傳特征已被固定，其子代個(gè)體數(shù)量性狀表現(xiàn)一致，個(gè)體之間差異較小，可以作為良種選育的一種有效方法。許多研究顯示，人工誘導(dǎo)多代減數(shù)雌核發(fā)育將大大加速魚類基因純合速度[31-33]，例如，大黃魚連續(xù)兩代減數(shù)雌核發(fā)育群體15個(gè)微衛(wèi)星座位的平均純合度高達(dá)0.803，群體內(nèi)個(gè)體間平均相似系數(shù)達(dá)0.867 2[31]。牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)為0.923 8，顯著高于對(duì)照組家系，證明連續(xù)多代人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育具有固定母本遺傳性狀的作用[32]。鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體內(nèi)個(gè)體間平均遺傳相似度達(dá)0.980 7，達(dá)到了快速建立純系的目的[33]。

團(tuán)頭魴浦江1號(hào)是原農(nóng)業(yè)部公告推廣的魚類良種，目前已成為我國(guó)團(tuán)頭魴養(yǎng)殖業(yè)的主導(dǎo)品種之一，鑒于沒有永遠(yuǎn)的良種的理念和推陳出新的時(shí)代要求，借助人工雌核發(fā)育技術(shù)，在浦江1號(hào)良種的基礎(chǔ)上，快速培育出性狀更加優(yōu)良且遺傳穩(wěn)定的品系具有十分重要的意義。上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源研究室早在2000年就成功開展了團(tuán)頭魴減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導(dǎo)，并陸續(xù)獲得了第一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體和連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體[12-13]。為使團(tuán)頭魴雌核發(fā)育家系的遺傳純合度得到更顯著的提升，本課題組對(duì)連續(xù)兩代雌核發(fā)育團(tuán)頭魴雌魚卵子再進(jìn)行減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)，成功培育出連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體，并應(yīng)用于良種選育實(shí)踐。本研究采用39條隨機(jī)引物對(duì)雌核發(fā)育一代群體(G1)、雌核發(fā)育二代群體(G2)和雌核發(fā)育三代群體(G3)基因組進(jìn)行RAPD分析，結(jié)果顯示，G1、G2和G3群體的多態(tài)位點(diǎn)比例分別為35.64%、27.00%和26.84%，遠(yuǎn)低于鯉(C.carpioL.)[20]、雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)[34]和唐魚(TanichthysalbonubesLin)[35]等魚類養(yǎng)殖群體的相應(yīng)參數(shù)。而且，多態(tài)位點(diǎn)比例隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而降低，即：G1>G2>G3，其中，G2比G1降低了24.24%，G3又比G2降低了0.59%，平均每代降低12.42%。G1、G2和G3群體的Shannon信息指數(shù)分別為0.1857、0.1461和0.1383，遠(yuǎn)低于鯉(C.carpioL.)[20]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[19]和雙棘黃姑魚(Nibeadiacanthus)[34]等魚類養(yǎng)殖群體的相應(yīng)參數(shù)。而且，Shannon信息指數(shù)隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而降低，即：G1>G2>G3，其中，G2比G1降低了21.32%，G3又比G2降低了5.34%，平均每代降低13.33%。多態(tài)位點(diǎn)比例和Shannon信息指數(shù)的結(jié)果一致表明，連續(xù)多代的人工減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)已使團(tuán)頭魴育種群體的遺傳多樣性明顯降低，并呈現(xiàn)逐代降低的趨勢(shì)。G1、G2和G3群體內(nèi)個(gè)體間的平均遺傳相似系數(shù)分別為0.853 8、0.896 8和0.906 0，呈現(xiàn)隨雌核發(fā)育世代數(shù)的增加而升高的趨勢(shì)，即：G3>G2>G1，其中，G2比G1升高了5.04%，G3又比G2升高了1.03%，平均每代升高3.04%。表明連續(xù)多代的人工減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導(dǎo)已使團(tuán)頭魴育種群體的遺傳純度明顯升高，并呈現(xiàn)逐代升高的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育能顯著加快團(tuán)頭魴基因的純合速度，使控制優(yōu)良性狀的基因快速純合化；所培育的雌核發(fā)育群體，尤其是雌核發(fā)育三代群體已經(jīng)是一個(gè)遺傳一致性較高的高純品系。此外，G3群體與對(duì)照組(F9群體) 間成對(duì)FST值為0.366 1，經(jīng)1 000次置換檢驗(yàn)得到的FST值的P值為0.000 0，已達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，顯示G3群體與對(duì)照組(F9群體)間已經(jīng)發(fā)生了極顯著的遺傳分化。這也說(shuō)明連續(xù)的雌核發(fā)育是快速建立具有特定遺傳特征品系的有效途徑，這在以往的研究報(bào)道[36-38]中已得到印證。本研究結(jié)果為連續(xù)多代人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育育種實(shí)踐提供了新的依據(jù)。

3.2 群體間鑒別標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)及其成因分析

人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育是使團(tuán)頭魴良種重要經(jīng)濟(jì)性狀基因快速純化和固定的主要途徑。但在實(shí)際的雌核發(fā)育育種實(shí)踐中，因雌核發(fā)育子代與普通團(tuán)頭魴在形態(tài)上極其相似，故使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法難以準(zhǔn)確區(qū)分雌核發(fā)育團(tuán)頭魴與普通團(tuán)頭魴群體。作為一種高效的分子遺傳標(biāo)記技術(shù)，RAPD技術(shù)標(biāo)記位點(diǎn)多，理論上，其檢測(cè)區(qū)幾乎覆蓋整個(gè)基因組，已成為魚類品種(系)鑒定和遺傳多樣性分析的有力工具。例如，劉敏等[39]從100條RAPD隨機(jī)引物的擴(kuò)增圖譜中找到了7條能區(qū)分雌核發(fā)育草魚與普通草魚群體的特異性條帶。賈海波等[18]從30個(gè)RAPD隨機(jī)引物中找到7個(gè)引物的擴(kuò)增譜帶用于鑒別兩個(gè)不同的紅白錦鯉雌核發(fā)育群體。

本研究從100條RAPD隨機(jī)引物中篩選到5條在群體間產(chǎn)生特異DNA片段的引物，根據(jù)這些引物擴(kuò)增到的特異DNA片段在群體內(nèi)的出現(xiàn)頻率，可以將它們分成兩類，第一類特異DNA片段在某個(gè)雌核發(fā)育群體中出現(xiàn)頻率為0，在對(duì)照組和其他雌核發(fā)育群體中出現(xiàn)頻率很高(71.43%～100%)。如引物S3擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約797 bp片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率均為100%(圖1)。引物S58擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約439 bp片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)71.43%～100%(圖3)。引物S71擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約504 bp片段在G2群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G3)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)71.43%～85.71%(圖4)。引物S75擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約313 bp片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為0，而在其他3個(gè)群體(F9、G1和G2)中的出現(xiàn)頻率高達(dá)85.71%～100%(圖5)。第二類特異DNA片段在某個(gè)雌核發(fā)育群體中出現(xiàn)頻率為100%，而在對(duì)照組和其他雌核發(fā)育群體中出現(xiàn)頻率很低(0～14.29%)。如，引物S3擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約136 bp片段在G3群體中出現(xiàn)頻率達(dá)100%，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率均為0(圖1)；引物S40擴(kuò)增出的一條長(zhǎng)約780 bp片段在G3群體中的出現(xiàn)頻率為100%，而在其他3個(gè)群體中的出現(xiàn)頻率僅為5.71%～14.29%(圖2)。

在人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的過(guò)程中，盡管因自然因素和人為因素的作用，也可能誘發(fā)突變，但雌核發(fā)育誘導(dǎo)本身并不能產(chǎn)生新的基因，而是通過(guò)等位基因頻率的變化，使一些有利的性狀得以積累和加強(qiáng)，一些有害隱性基因控制的性狀也會(huì)因基因座位的純合化而表達(dá)出來(lái)，從而被淘汰。產(chǎn)生第一類特異DNA片段的原因，可能是雌核發(fā)育團(tuán)頭魴群體近交水平和遺傳純度較高，各等位基因在一定程度上被固定，因而頻率上升，譜帶數(shù)目減少。此種現(xiàn)象已在多種魚類雌核發(fā)育群體中被觀察到，劉敏等[39]從100條RAPD隨機(jī)引物的擴(kuò)增圖譜中找到了7條能區(qū)分雌核發(fā)育草魚與普通草魚群體的特異性條帶，其中6條僅存在于普通草魚中，在異精雌核發(fā)育草魚F1中缺失。張虹[40]從180條RAPD隨機(jī)引物中篩選到一個(gè)引物(S68)作為鑒別雌核發(fā)育草魚和普通草魚的分子標(biāo)記，該引物在普通草魚群體中擴(kuò)增到一條1 311 bp條帶，而在雌核發(fā)育草魚群體中未擴(kuò)增到相應(yīng)條帶。

第二類特異DNA片段的出現(xiàn)違背了雌核發(fā)育過(guò)程中遺傳物質(zhì)缺失的普遍規(guī)律，筆者認(rèn)為可能有以下兩個(gè)方面的原因：第一，可能是“異精效應(yīng)”結(jié)果[41]，一般認(rèn)為，雌核發(fā)育子代沒有出現(xiàn)父本的遺傳物質(zhì)[42]，但也有大量研究表明雌核發(fā)育子代中整合了部分父本遺傳信息。鄒桂偉等[43]采用44條RAPD隨機(jī)引物對(duì)連續(xù)兩代雌核發(fā)育鰱、雄鯉和普通鰱進(jìn)行RAPD分析后發(fā)現(xiàn)，有10條引物出現(xiàn)了雌核發(fā)育鰱與父本(雄鯉)相同的DNA片段，而野生長(zhǎng)江鰱(親本鰱)則沒有，表明雌核發(fā)育鰱基因組DNA可能帶有父本基因組DNA的特性。張海發(fā)等[44]對(duì)異精激發(fā)的彭澤鯽雌核發(fā)育子一代及其雙親進(jìn)行RAPD分析后發(fā)現(xiàn)，異育彭澤鯽子一代中含有少數(shù)與父本相同而與母本相異的特異條帶，表明彭澤鯽已不再是完全的母性遺傳，異育彭澤鯽基因組DNA中可能帶有部分異源父本基因組DNA的特性。本研究中第二類特異DNA片段的出現(xiàn)是否為“異精效應(yīng)”作用的結(jié)果還有待通過(guò)進(jìn)一步研究其與父母本的遺傳關(guān)系來(lái)證實(shí)。第二，第二類特異DNA片段的出現(xiàn)可能與雌核發(fā)育團(tuán)頭魴的原始母本來(lái)源有關(guān)，G1群體的母本為團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F6，G2群體由G1群體中的雌魚誘導(dǎo)而來(lái)，G3群體由G2群體中的雌魚誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此，雌核發(fā)育團(tuán)頭魴的母本為團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F6的部分個(gè)體。而F9群體是以團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F6為基礎(chǔ)，再經(jīng)連續(xù)3代人工選育而來(lái)，由此可知，F(xiàn)9群體與3個(gè)雌核發(fā)育群體(G1、G2、G3)有著相似的親本來(lái)源，但在實(shí)際育種過(guò)程中，也可能因某些因素(如，繁育群體的非隨機(jī)交配、遺傳漂變等)的影響而導(dǎo)致基因重組進(jìn)而產(chǎn)生新的遺傳變異，但這還有待進(jìn)一步的研究確認(rèn)。