具有潛在降血糖作用乳酸菌的篩選

劉 順,謝遠(yuǎn)紅,張紅星,金君華

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測(cè)與控制北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206;)

近年來(lái),糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng),成為21世紀(jì)全球面臨的最嚴(yán)重、最危急的健康問(wèn)題之一[1]。世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)顯示,中國(guó)糖尿病的患病率至2017年已居世界首位,人數(shù)約1.1億,約占中國(guó)成年人總數(shù)的1/10。依照目前發(fā)展趨勢(shì),到2040年,我國(guó)患者將超過(guò)1.5億[2],快速增長(zhǎng)的糖尿病人群將會(huì)加大各國(guó)醫(yī)療系統(tǒng)的壓力,據(jù)研究報(bào)道,2015年,全球糖尿病花費(fèi)為6730億美元,預(yù)測(cè)在2040年將達(dá)到8020億美元[3]。

目前,治療Ⅱ型糖尿病主要方法是藥物治療,如二甲雙胍、格列汀類藥物、α-葡萄糖苷酶抑制劑等,其中,二甲雙胍和格列汀類藥物對(duì)人體具有一定的副作用[4],而α-葡萄糖苷酶抑制劑具有較好的降糖作用而且對(duì)人體臟器無(wú)明顯毒副作用[5]。

α-葡萄糖苷酶的作用是參與碳水化合物的分解,抑制α-葡萄糖苷酶的活性可以降低人體血液中的血糖水平[6]。目前已經(jīng)上市的α-葡萄糖苷酶抑制劑類降糖藥僅有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇三種,且均為外國(guó)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品,國(guó)內(nèi)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的該類藥物鮮有報(bào)道,所以研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的α-葡萄糖苷酶抑制劑類藥物具有一定意義。

乳酸菌具有多種益生功能,因其性質(zhì)溫和、作用效果明顯且持久穩(wěn)定的特點(diǎn)成為了國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn),其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用已被證實(shí)。Zeng等[7]發(fā)現(xiàn)7株乳桿菌無(wú)細(xì)胞分泌上清具有α-糖苷酶的抑制能力,Panwar等[8]證明存在于人腸道中的乳桿菌菌株具有α-葡糖苷酶和β-葡萄糖苷酶抑制活性,并且可以降低體內(nèi)血糖反應(yīng)[2]。并且有研究表明,乳酸菌對(duì)大鼠的高血糖癥狀以及人的Ⅱ型糖尿病有一定的改善作用[1,5,9-10]。

為了得到具有良好抑制α-葡萄糖苷酶作用和益生效果的乳酸菌,本實(shí)驗(yàn)以被證實(shí)具有降血糖作用的商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌LGG[11]為對(duì)照,對(duì)分離自天然食品的36株乳酸菌進(jìn)行體外篩選,初步研究其降血糖作用,可為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)新型功能性乳酸菌產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌 詳細(xì)信息見(jiàn)表1;植物乳桿菌Zhang-LL(CGMCC 6936) 由北京農(nóng)學(xué)院(功能性乳品實(shí)驗(yàn)室)凍藏保存;鼠李糖乳桿菌LGG(ATCC 53103) 由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、α-葡萄糖苷酶 美國(guó)Sigma;MRS培養(yǎng)基 北京路橋技術(shù)股份有限公司;無(wú)水碳酸鈉(分析純)、牛膽鹽(純度70%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;鹽酸、氫氧化鈉 分析純,北京化工場(chǎng);人工胃液、人工小腸液 北京欣華綠源科技有限公司。

表1 不同來(lái)源乳酸菌

DL-CJ-2ND I型潔凈操作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;SCILOGEX MX-S型漩渦振蕩器海門市其林貝爾公司;BSA224S型精密電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司;ELx808型酶標(biāo)儀 美國(guó)基因有限公司;SKP-03B型恒溫培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;Eppendoef centrifuge 5417R型冷凍離心機(jī) 北京博宇寶威實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;MLS-3750型高壓滅菌鍋 日本SANYO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 將在-80 ℃保菌管中保藏的乳酸菌以2%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h,共活化三代。

1.2.2 樣品的制備 菌株活化三代后,調(diào)整菌懸液密度為1×109CFU/mL,4 ℃下6000 r/min離心10 min,收集發(fā)酵上清液。發(fā)酵上清液用0.22 μm水系濾膜過(guò)濾得發(fā)酵上清液樣品。

1.2.3α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定 參考Pierre等[12]和Zhang等[13]的方法并進(jìn)行修改,以被證實(shí)具有降血糖作用的商業(yè)菌株鼠李糖乳桿菌LGG的α-葡萄糖苷酶抑制率為對(duì)照。在96孔板210 μL的反應(yīng)體系中,加入50 μL PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)和50 μL濃度為2.5 mmol/L的PNPG溶液,37 ℃孵育10 min。然后加入30 μL濃度為0.4 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液37 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min,最后加入50 μL的濃度為1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)。反應(yīng)完成后,于酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定吸光值。用PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)作為α-葡萄糖苷酶溶液和待測(cè)樣品的空白對(duì)照,每組設(shè)定3個(gè)平行。

式中:A為樣品組,含有樣品溶液和α-葡萄糖苷酶溶液;B為樣品空白組,含有樣品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液;C為對(duì)照組,不含樣品溶液含α-葡萄糖苷酶溶液;D為空白組,不含樣品溶液不含α-葡萄糖苷酶溶液。

1.2.4α-淀粉酶抑制率的測(cè)定 以LGG的α-淀粉酶抑制率為對(duì)照,對(duì)具有較好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株進(jìn)行α-淀粉酶抑制率的測(cè)定。參考龍楚媚等[14]方法。用0.25 mL樣品溶液與1 mg/mL的α-淀粉酶溶液等體積混合,于37 ℃孵育10 min,然后將反應(yīng)液加入至37 ℃的0.5 mL的1.5%的可溶性淀粉溶液中,于37 ℃反應(yīng)5 min,再加入1 mL DNS溶液,在沸水浴中反應(yīng)5 min后迅速冷卻至室溫,稀釋10倍后靜置30 min,并于540 nm處測(cè)定吸光值。用PBS溶液(0.1 mol/L,pH=6.8)作為α-淀粉酶溶液和待測(cè)樣品的空白對(duì)照,每組設(shè)定3個(gè)平行。

其中:A為樣品組,含有樣品溶液和α-淀粉酶溶液;B為樣品空白組,含有樣品溶液不含α-淀粉酶溶液;C為對(duì)照組,不含樣品溶液含α-淀粉酶溶液;D為空白組,不含樣品溶液不含α-淀粉酶溶液。

1.2.5 耐酸實(shí)驗(yàn) 配制MRS肉湯,用HCl調(diào)節(jié)pH分別為2.5和3.0,121 ℃高壓滅菌15 min。將具有較好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接種量分別接入pH為2.5、3.0的MRS肉湯中,37 ℃培養(yǎng)8 h后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù),以pH為6.8的MRS肉湯作為對(duì)照,每組3個(gè)平行,分別測(cè)定其存活率。

1.2.6 耐膽鹽實(shí)驗(yàn) 參考周曉瑩[15]的方法并進(jìn)行修改,將具有較好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接種量分別接入含0.2%、0.3%、0.4%牛膽鹽的MRS肉湯中,37 ℃培養(yǎng)4h后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定其活菌數(shù),以不加膽鹽的MRS肉湯作為對(duì)照,每組3個(gè)平行,分別測(cè)定其存活率。

1.2.7 耐人工胃腸液實(shí)驗(yàn) 將具有較好α-葡萄糖苷酶抑制率的菌株活化后以2%接種量接入pH=3的人工胃液中,37 ℃培養(yǎng)3 h后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),以0 h時(shí)活菌數(shù)對(duì)比計(jì)算存活率。將在人工胃液中培養(yǎng)了3 h的菌液以2%接種量接入pH=8的人工腸液中,37 ℃培養(yǎng)8 h后用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),以3 h時(shí)人工胃液中活菌數(shù)作為對(duì)比。每組三個(gè)平行,分別測(cè)定其存活率。

胃液中菌株存活率(%)=胃液培養(yǎng)8 h后活菌數(shù)/胃液培養(yǎng)0 h時(shí)活菌數(shù)×100

腸液中菌株存活率(%)=腸液培養(yǎng)8 h時(shí)活菌數(shù)/胃液培養(yǎng)8 h時(shí)活菌數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)以p<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌α-葡萄糖苷酶抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,發(fā)酵上清液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率最高的4株菌分別為YDA11、OD1、OD2和YDB24,其抑制率分別為28.37%、30.26%、30.26%和33.18%,對(duì)照菌株LGG抑制率為31.78%,且這4株菌均與對(duì)照菌LGG抑制率無(wú)顯著性差異(p>0.05),不同菌株發(fā)酵上清液的α-葡萄糖苷酶抑制率相差較大,這可能是具有α-葡萄糖苷酶抑制能力的為菌株的胞外產(chǎn)物,而不同菌株產(chǎn)生該類胞外物質(zhì)的能力不一。選取對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率較高的YDA11、OD1、OD2和YDB24做進(jìn)一步研究。

表2 菌株發(fā)酵液對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率

2.2 菌株α-淀粉酶抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

α-淀粉酶是一種重要的淀粉水解酶,它能夠切斷淀粉內(nèi)部的糖苷鍵,產(chǎn)生糊精、低聚糖和葡萄糖等[16]。能夠促進(jìn)食物中碳水化合物的水解和消化,促進(jìn)糖分的攝入,從而提高了血糖和血脂含量水平[17]。人體進(jìn)食后,α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶協(xié)同促進(jìn)血糖的升高,,進(jìn)而引發(fā)高血糖癥狀。具有良好α-葡萄糖苷酶抑制率的四株菌YDB24、YDA11、OD2和OD1對(duì)α-淀粉酶的抑制率見(jiàn)表3。其中菌株YDA11與對(duì)照菌株LGG抑制率無(wú)顯著性差異(p>0.05)。同時(shí),菌株OD1和OD2對(duì)α-淀粉酶的抑制率顯著高于LGG(p<0.05),由此可見(jiàn),菌株OD1和OD2對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制作用。

表3 菌株發(fā)酵液對(duì)α-淀粉酶抑制率

2.3 菌株耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

能夠耐受胃部酸性環(huán)境是益生菌能夠進(jìn)入腸道發(fā)揮作用的一大前提,人體空腹時(shí)胃液pH在2.0以下,進(jìn)食后胃液pH在3.0左右,因此,本實(shí)驗(yàn)分別以pH為2.5和3.0的酸性環(huán)境對(duì)菌株耐酸能力進(jìn)行測(cè)定。由圖1可知,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1經(jīng)過(guò)體外耐酸性實(shí)驗(yàn)8 h的培養(yǎng),表現(xiàn)出了不同的耐酸能力。在pH2.5的環(huán)境中,菌株YDA11與菌株OD1耐酸能力較差,存活率分別為84.49%與89.04%,且與菌株LGG具有顯著性差異(p<0.05);菌株YDB24與菌株OD2耐酸能力較好,存活率分別為96.01%與96.83%;在pH3.0的環(huán)境中,全部4株菌的存活率都在100%以上,菌株OD2存活率顯著高于LGG(p<0.05)。所以,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1均表現(xiàn)出良好的耐酸能力。

圖1 乳酸菌耐酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 菌株耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知,菌株YDB24、YDA11、OD2和OD1在含不同濃度的牛膽鹽MRS肉湯中脅迫4 h后,表現(xiàn)出不同的耐受能力。菌株OD2在0.3%牛膽鹽培養(yǎng)基中存活率可達(dá)到94.81%,與對(duì)照菌株LGG無(wú)顯著性差異(p>0.05);在0.4%的高濃度膽鹽環(huán)境下,菌株OD2存活率依然能夠達(dá)到68.48%,植物乳桿菌OD2表現(xiàn)出最強(qiáng)的膽鹽耐受能力。

圖2 菌株耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 菌株耐人工胃腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果

人體胃液中的HCl和胃蛋白酶以及腸道中堿性環(huán)境和胰蛋白酶是對(duì)益生菌發(fā)揮作用的一大考驗(yàn)。由圖3可知,實(shí)驗(yàn)菌株在pH=3.0的人工胃液中脅迫3 h后,菌株YDB24與OD2存活率分別為91.48%和94.22%,與對(duì)照菌株LGG無(wú)顯著性差異(p>0.05),表現(xiàn)出良好的耐受能力;轉(zhuǎn)入人工小腸液中繼續(xù)脅迫8 h后,菌株YDB24、YDA11和OD1存活率均顯著低于LGG(p<0.05),菌株OD2存活率為79.99%與LGG無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

圖3 菌株耐人工胃腸液實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

益生菌來(lái)源的α-葡萄糖苷酶抑制劑是當(dāng)下研究降血糖問(wèn)題的熱點(diǎn),具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制率從側(cè)面也反映了該益生菌的潛在降血糖價(jià)值。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,36株乳酸菌對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率能力不一,以菌株YDA11、OD1、OD2、YDB24表現(xiàn)最佳,而在進(jìn)一步的篩選實(shí)驗(yàn)中菌株OD2綜合性能與對(duì)照菌株LGG最接近,因此,篩選出植物乳桿菌OD2為具有潛在降血糖能力的菌株。

目前國(guó)內(nèi)有關(guān)微生物來(lái)源的α-葡萄糖苷酶抑制劑的研究不多。陳佩等[18]研究的干酪乳桿菌CCFM0412對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為29.61%;張軍蒙等[19]發(fā)現(xiàn)從傳統(tǒng)乳酸菌發(fā)酵食品中篩選出來(lái)的乳雙歧桿菌1號(hào)BA01對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到37.48%。而在測(cè)定α-淀粉酶抑制率的實(shí)驗(yàn)中,植物乳桿菌OD2抑制率顯著高于對(duì)照菌株LGG(p<0.05),說(shuō)明植物乳桿菌OD2在同類特性菌株中表現(xiàn)良好。

乳酸菌能發(fā)揮自身益生功能的前提就是能以有效的活菌數(shù)進(jìn)入腸道并在腸道中正常的生長(zhǎng)代謝,所以就要求篩選出的乳酸菌具有一定的耐受能力。刑良英等[20]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌WHH734在pH=2.5的環(huán)境下存活率可達(dá)96.85%;而唐雅茹[21]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS1.0386在pH3.0的酸性環(huán)境中培養(yǎng)3 h的存活率為84.62%,本實(shí)驗(yàn)中篩選的植物乳桿菌OD2在pH為2.5和3.0的環(huán)境中存活率分別能達(dá)到96.83%和104.06%,對(duì)比表明植物乳桿菌OD2具有良好的耐酸能力。

胃腸道中的環(huán)境是對(duì)益生菌的一大考驗(yàn)。人體腸道中膽鹽濃度一般為0.3%左右,菌株OD2在0.3%膽鹽環(huán)境中脅迫4 h后存活率與對(duì)照菌株LGG無(wú)顯著性差異(p<0.05),且在0.4%的膽鹽中存活率仍能達(dá)到68.48%;在耐人工胃腸液實(shí)驗(yàn)中,植物乳桿菌OD2在胃液中和腸液中存活率分別為94.22%和79.99%,而云月英等[22]研究發(fā)現(xiàn)從自然發(fā)酵肉制品中分離的乳酸菌M12H和M13在pH=3的人工胃液中存活率為68.66%和56.72%,陳佩等[18]研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌CCFM0412在pH=8的人工腸液中可存活8h,存活率達(dá)到90.98%。說(shuō)明植物乳桿菌OD2具有良好的胃腸道耐受能力。

乳酸菌在食品行業(yè)以及發(fā)酵工業(yè)等具有廣闊的發(fā)展前景,而本實(shí)驗(yàn)中植物乳桿菌OD2良好的α-葡萄糖苷酶抑制率和胃腸道環(huán)境耐受能力,使其在實(shí)際應(yīng)用中價(jià)值更加廣泛。