QuEChERS液質(zhì)聯(lián)用法測定禽源性食品中苯基吡唑類殺蟲劑殘留

周 佳,蘇阿龍,朱書強,王麗君,禹 潔

(甘肅省食品檢驗研究院,甘肅蘭州 730000)

苯基吡唑類殺蟲劑是一類吡唑環(huán)上取代位和取代基多的化合物,由于其活性強,市場化的吡唑類化合物非常多[1],其中最常見的苯基吡唑類殺蟲劑就是氟蟲腈及其代謝物、氟蟲腈的類似物。氟蟲腈能夠殺滅跳蚤、虱子、蜱蟲、蟑螂、螨蟲等[2-4]。而且氟蟲腈在施用后會產(chǎn)生毒性更強的代謝物:氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜和氟甲腈[5-8]。氟蟲腈及其代謝物的危害主要在于人體攝入后會影響神經(jīng)系統(tǒng)并且會損傷肝臟、甲狀腺等[5,9]。2017年爆發(fā)于歐洲的鮮蛋氟蟲腈事件嚴(yán)重影響鮮蛋行業(yè)有序發(fā)展[10]。其實,歐盟早已禁止氟蟲腈在食品產(chǎn)業(yè)畜禽養(yǎng)殖中使用,中華人民共和國農(nóng)業(yè)部在2009年也已發(fā)布公告明確了氟蟲腈的使用范圍[9，11],GB 2763-2016中對于氟蟲腈的允許使用范圍及限量也有明確要求,氟蟲腈在禽源性食品中是不得檢出。自此行業(yè)研發(fā)人員開啟了同等效用氟蟲腈類似物的研究序幕。由于氟蟲腈類似物的化學(xué)結(jié)構(gòu)與氟蟲腈類似,該類物質(zhì)也可以達(dá)到殺滅跳蚤、虱子、蜱蟲、蟑螂、螨蟲等的作用,目前已市場化的產(chǎn)品就是乙蟲腈和丁烯氟蟲腈。德國拜耳公司開發(fā)的乙蟲腈是氟蟲腈的乙基類似物,它的活性比氟蟲腈高,易合成。乙蟲腈是通過破壞中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常活動致死昆蟲[12-13]。丁烯氟蟲腈也是在氟蟲腈基礎(chǔ)上開發(fā)出來的新型殺蟲劑,它具有高活性、光譜殺蟲的特點[14]。丁烯氟蟲腈對鱗翅目害蟲具有與氟蟲腈同等的活性,但是有研究表明丁烯氟蟲腈在環(huán)境中有移動性而且代謝時間長[15]。綜上,建立同時檢測上述6種苯基吡唑類殺蟲劑的快速方法非常必要。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道及標(biāo)準(zhǔn),氟蟲腈及其代謝物的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Gas Chromatography-mass Spectrometer)GC-MS[16-20]、高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography)LC[21]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid Chromatography-mass Spectrometer)LC-MS[22]、氣相色譜法(Gas Chromatography)GC[23-24]、等。乙蟲腈的檢測方法有LC[25]、GC[23-24]、LC-MS[13]等。丁烯氟蟲腈的檢測方法有GC[26-27]、GC-MS[28]、LC-MS[29-30]等。這些檢測方法大都步驟復(fù)雜、成本高、耗時長、損失大,研究內(nèi)容均為氟蟲腈及其代謝物在各種不同基質(zhì)中的檢測,并無同時檢測多種苯基吡唑類殺蟲劑的方法研究,針對禽源性食品中苯基吡唑類殺蟲劑的研究報道更是空白。

綜上,本方法采用乙腈提取,QuEChERS方法凈化,基于UHPLC-MS/MS的MRM模式,對禽源性食品中6種苯基吡唑類殺蟲劑殘留的分析方法進(jìn)行研究,以期達(dá)到比傳統(tǒng)方法步驟更簡單、回收率更穩(wěn)定、參數(shù)更優(yōu)化、適用范圍更廣的效果,同時達(dá)到填補苯基吡唑類殺蟲劑在禽源性食品中檢測方法的空白,為相關(guān)單位制定風(fēng)險監(jiān)測方案及市場監(jiān)管提供參考的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

禽蛋、禽肉、禽內(nèi)臟 均來自于甘肅各地州市農(nóng)貿(mào)市場;氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、乙蟲腈(標(biāo)準(zhǔn)品) 純度>98%,德國Dr.公司;丁烯氟蟲腈(標(biāo)準(zhǔn)品) 大連瑞澤農(nóng)藥股份有限公司;乙腈(色譜純) 德國MERCK;乙酸銨、甲酸(色譜純) 美國Fisher公司;N-丙基乙二胺(primary secondary amine)PSA、十八烷基硅膠C18上海安譜實驗科技有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

QTRAP 5500三重四級桿液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI)及Analyst?數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國AB公司;Vortex 3型渦旋振蕩器 德國IKA公司;Avanti J-25落地式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司;純水機 美國thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 禽蛋類樣品:取內(nèi)容物打散后,用均質(zhì)機充分均質(zhì),分裝入潔凈的容器密封,-20 ℃保存;禽肉及禽內(nèi)臟類樣品:分解切碎后,用均質(zhì)機充分均質(zhì),分裝入潔凈的容器密封,-20 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理 禽蛋類樣品:準(zhǔn)確稱取2 g待測樣品于50 mL離心管中,加入乙腈10 mL,搖勻后超聲提取15 min;加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、50 mg C18,渦旋2 min,10000 r/min離心(4 ℃)5 min。移取0.55 mL乙腈層,加入0.45 mL水,渦旋1 min,經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,待測。

禽肉及禽內(nèi)臟類樣品:準(zhǔn)確稱取2 g待測樣品于50 mL離心管中,加入5 mL水渦旋分散,加入乙腈10 mL,以下操作同“禽蛋類樣品”。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜、乙蟲腈0.01 g(精確至0.0001 g),于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈溶解定容,配制成單一的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1000 μg/mL),于-20 ℃下保存。按照各化合物的響應(yīng)不同選擇線性范圍,配制6種苯基吡唑類殺蟲劑的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。準(zhǔn)確吸取適量標(biāo)準(zhǔn)混合使用液于10 mL棕色容量瓶中,用55%乙腈水定容即得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,2～8 ℃保存7 d。

1.2.4 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column(規(guī)格100 mm×2.1 mm,粒徑1.7 μm);流速0.3 mL/min;柱溫35 ℃;流動相:A(乙腈)+B(水);梯度洗脫條件:0～3.0 min 55%～70% A,3.0～3.5 min 70%～98% A,3.5～5.0 min 98% A,5.0～5.5 min 98%～55% A,5.5～8.0 min 55% A。進(jìn)樣量5 μL。

1.2.5 質(zhì)譜條件 離子源:Electron Spray Ionization(ESI);離子化電壓:-4500 V;輔助加熱氣壓力:55 psi;噴霧氣壓力:50 psi;輔助加熱氣溫度:550 ℃;動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;負(fù)離子掃描;6種苯基吡唑類殺蟲劑的色譜質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 苯基吡唑類殺蟲劑色譜質(zhì)譜參數(shù)

1.2.6 檢出限和定量限 按照各目標(biāo)物的響應(yīng)分別計算信噪比S/N，以3倍信噪比(S/N=3)計算各目標(biāo)物的檢出限(LOD)，以10倍信噪比計算各目標(biāo)物的定量限(LOQ)。

1.2.7 加標(biāo)回收率試驗和精密度試驗 參考六種苯基吡唑類殺蟲劑的定量限，對各目標(biāo)物選擇3種不同濃度進(jìn)行加標(biāo)回收率驗，按照1.2.2進(jìn)行樣品提取并按照1.2.4和1.2.5的色譜質(zhì)譜條件分別進(jìn)樣，每個樣品平行進(jìn)樣5次，計算回收率和RSD。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將獲得的數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入AB Sciex MultiQuantTM軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以各目標(biāo)物的保留時間作為篩查依據(jù),以離子峰度比作為確證依據(jù)，進(jìn)行定性判斷；同時繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的各目標(biāo)物進(jìn)行定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化材料優(yōu)化

針對不同材料的吸附特性(比如,PSA用于吸附雜質(zhì)中的碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類和少量的色素;C18用于吸附脂肪和酯類等非極性化合物),結(jié)合樣品中雜質(zhì)的性質(zhì),本方法選用C18、C18+PSA對禽源性樣品進(jìn)行凈化,同時考察凈化材料對目標(biāo)物的吸附情況。樣品按照1.2.2處理,氟蟲腈及其代謝物、乙蟲腈、丁烯氟蟲腈的添加水平分別為0.10、1.00、2.00 μg/kg,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。結(jié)果顯示,采用單獨C18凈化,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在89.6%～117.4%范圍內(nèi),RSD為1.8%～4.7%;采用C18+PSA混合凈化,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在88.6%～113.1%范圍內(nèi),RSD為2.0%～5.5%。綜上,選擇C18作為樣品前處理的凈化材料。進(jìn)而考察C18的添加量,當(dāng)樣品量為2 g,C18添加量為50 mg時,譜圖顯示樣品基質(zhì)噪音降低明顯,繼續(xù)增大C18的添加量并沒有明顯的差別,所以選擇50 mg作為前處理步驟中C18的添加量。

2.2 待測液溶劑對響應(yīng)的影響

采用乙腈作為待測液溶劑,質(zhì)譜分析后,目標(biāo)物均出現(xiàn)峰展寬、分叉的現(xiàn)象(如圖1A),這是由于純乙腈的洗脫強度大于乙腈-水,使得目標(biāo)物出峰變形并且柱效下降,即產(chǎn)生了溶劑效應(yīng)。為了消除溶劑效應(yīng)對于目標(biāo)物響應(yīng)的影響,本方法將乙腈更換為55%乙腈+45%水,由于該待測液溶劑與流動相相似,所以消除的溶劑效應(yīng),分析后6種苯基吡唑類殺蟲劑的峰形有明顯改善,峰形變得尖銳、窄(如圖1B)。綜上,本方法選用乙腈-水(55%+45%)作為待測液溶劑。

圖1 溶劑對苯基吡唑類殺蟲劑峰形的影響

2.3 流動相優(yōu)化

考慮到流動相對目標(biāo)物峰形、靈敏度的影響,本方法重點關(guān)注了流動相的選擇。選擇六種流動相進(jìn)行考察:乙腈-水;甲醇-水;乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸);甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸);乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液;甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液。采用100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液作為分析對象,各流動相體系下目標(biāo)物的峰面積比較見表2。大部分苯基吡唑類殺蟲劑在乙腈-水體系中響應(yīng)高,氟蟲腈砜在甲醇-水體系中響應(yīng)較高。在甲醇體系中目標(biāo)物均出現(xiàn)了峰變寬、分叉。在乙酸銨體系中,由于緩沖鹽解離后偏酸性,抑制目標(biāo)物離子化,導(dǎo)致目標(biāo)物信號響應(yīng)降低一倍左右。在甲酸酸化緩沖鹽體系中,由于甲酸的酸性更強,抑制目標(biāo)物離子化更明顯,目標(biāo)物的響應(yīng)降低2～5倍。綜上,選擇乙腈-水作為流動相。

表2 不同流動相下苯基吡唑類殺蟲劑的峰面積

2.4 MS/MS參數(shù)的優(yōu)化

比較正、負(fù)離子掃描模式下6種苯基吡唑類殺蟲劑的響應(yīng),選擇適合6種苯基吡唑類殺蟲劑的電離方式和分子離子峰。在ESI-模式下,6種苯基吡唑類殺蟲劑的Q1掃描圖中可以清晰的看到同位素峰的存在(圖2),這是因為該類化合物的分子結(jié)構(gòu)中均含有2個Cl原子(自然界中Cl以Cl-35和Cl-37兩種形式存在)的原因。按照目標(biāo)物響應(yīng)高且容易獲得(碰撞電壓相對較低)的原則,各選擇2個離子對作為定量、定性離子對。

圖2 6種苯基吡唑類殺蟲劑的Q1全掃描質(zhì)譜圖

例如氟甲腈,當(dāng)去簇電壓從0～-300 V變化時,首先由于目標(biāo)物離子與溶劑分子形成的簇離子隨著電壓的增強而減少,目標(biāo)物加和離子的響應(yīng)是逐漸增強的;但是當(dāng)電壓超過某一個值之后,目標(biāo)物加和離子的響應(yīng)出現(xiàn)驟減,這是由于該目標(biāo)離子的源內(nèi)裂解造成的。最終選擇-120 V作為氟甲腈的去簇電壓。當(dāng)碰撞電壓從0～-200 V變化時,首先隨著碰撞電壓的增加,目標(biāo)物加和離子化學(xué)鍵碎裂,目標(biāo)子離子的響應(yīng)增強,當(dāng)電壓超過某一個值時,目標(biāo)子離子的響應(yīng)出現(xiàn)明顯的下降,這是由于電壓太大將子離子進(jìn)一步打碎的結(jié)果。最終選擇-18 V作為387.0/351.0的碰撞電壓,選擇-45 V作為387.0/281.9的碰撞電壓。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表1。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

在液相-質(zhì)譜分析中,樣品中除目標(biāo)物之外的其他成分會對目標(biāo)物的測定造成影響,即基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)按照其對目標(biāo)物響應(yīng)的影響分為基質(zhì)增強效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實驗參考Gosetti等[31]的方法考察了基質(zhì)效應(yīng),采用三種類型的樣品按照1.2.2前處理,用得到的空白基質(zhì)溶液分別配制三條基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時用初始流動相配制溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算方法如下:

X(基質(zhì)效應(yīng))=(標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率-基質(zhì)加標(biāo)曲線斜率)×100/標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

由表3可知,6種苯基吡唑類殺蟲劑的X<1%,即6種苯基吡唑類殺蟲劑均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。綜上,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

表3 苯基吡唑類殺蟲劑的基質(zhì)效應(yīng)(%)

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 線性關(guān)系與定量限 氟蟲腈及其代謝物的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為1～40 μg/kg,決定系數(shù)(R2)>0.9980;丁烯氟蟲腈的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為10～400 μg/kg,決定系數(shù)(R2)>0.9940;乙蟲腈的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為4～160 μg/kg,決定系數(shù)(R2)>0.9980。以3倍信噪比(S/N=3)計算各目標(biāo)物的檢出限(LOD),以10倍信噪比計算各目標(biāo)物的定量限(LOQ),6種苯基吡唑類殺蟲劑的檢出限為0.02～0.40 μg/kg,定量限為0.06～1.20 μg/kg。(見表4)

表4 苯基吡唑類殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、定量限數(shù)據(jù)

由表4可知,在不同的畜禽樣品中同一個殺蟲劑的檢出限與定量限會有輕微的差別,這是由于基質(zhì)不同所引起的,但是均可以滿足檢測的需要。

2.6.2 回收率和精密度 本方法采用三類禽源性樣品(禽蛋、禽肉、禽內(nèi)臟)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)添加實驗,向空白禽源性樣品中添加不同水平的氟蟲腈及其代謝物(1#為0.05 μg/kg、2#為0.50 μg/kg、3#為1.00 μg/kg)、丁烯氟蟲腈(1#為1.00 μg/kg、2#為10.00 μg/kg、3#為20.00 μg/kg)和乙蟲腈(1#為0.50 μg/kg、2#為5.00 μg/kg、3#為10.00 μg/kg)。按1.2.2步驟操作,6種苯基吡唑類殺蟲劑的回收率在84.49%～107.86%范圍內(nèi),RSD在0.99%～4.19%范圍內(nèi)。具體數(shù)據(jù)見表5。

表5 苯基吡唑類殺蟲劑在不同添加水平下的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)

2.7 實際樣品檢測

采用本方法對禽蛋、禽內(nèi)臟、禽肉進(jìn)行實際樣品測試,檢出陽性樣品3份。其中1份鮮蛋檢出氟蟲腈,1份雞肉檢出氟蟲腈,1份雞肝檢出氟甲腈。氟蟲腈陽性樣品和10 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中6種苯基吡唑類殺蟲劑的特征譜圖見圖3。由圖3可知,A樣品中保留時間與定性、定量離子均與氟蟲腈的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品相匹配,檢出氟蟲腈。

圖3 雞蛋陽性樣品及氟蟲腈標(biāo)準(zhǔn)品的提取離子流圖

3 結(jié)論

本方法通過QuEChERS方法凈化,ESI-negative-MRM質(zhì)譜分析,建立了快速、高效、同時檢測禽源性食品中6種苯基吡唑類殺蟲劑的檢測方法。6種苯基吡唑類殺蟲劑的定量限范圍在為0.06～1.20 μg/kg,在不同線性范圍(1～40、4～160、10～400 μg/kg)下決定性良好(R2>0.994)。

針對6種苯基吡唑類殺蟲劑分別進(jìn)行三類樣品基質(zhì)的3水平標(biāo)準(zhǔn)添加測試,回收率達(dá)84.49%～107.86%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.99%～4.19%。

QuEChERS方法凈化操作簡單,樣品僅需簡單提取、凈化即可進(jìn)行上機測試得出結(jié)果,前處理的經(jīng)濟(jì)成本與時間成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)方法,具有非常好的推廣應(yīng)用價值。本方法在禽源性食品中得到了很好的應(yīng)用,但對于植物源性食品的檢測,還需確定其適用范圍和條件進(jìn)一步研究。該方法的建立相關(guān)單位制定風(fēng)險監(jiān)測方案及市場監(jiān)管提供了參考。